埃博拉病毒萊斯頓亞型實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測引物對(duì)及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及埃博拉病毒萊斯頓亞型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測引物對(duì)及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 埃博拉出血熱是嚴(yán)重的、往往致命的人類疾病，病死率高達(dá)90%。它是世界上最兇 猛的疾病之一。其傳播感染的途徑是直接接觸受感染的動(dòng)物或人的血液、體液和組織。病 情嚴(yán)重的患者需要獲得重癥支持治療。疫情期間，與患者或死者有密切接觸的衛(wèi)生工作者、 家人以及其他人面臨較高的感染風(fēng)險(xiǎn)。
[0003] 埃博拉病毒屬于絲狀病毒科，絲狀病毒屬，其基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA， 病毒顆粒為長微絲狀，直徑約100nm，其長度為33?1500nm，平均970nm。埃博拉病毒可分 為扎伊爾型、蘇丹型、本迪布焦型、塔伊森林型和萊斯頓型。目前，除萊斯頓型僅發(fā)現(xiàn)對(duì)人不 致病外，其余四種亞型感染后均可導(dǎo)致人發(fā)病。雖然目前僅發(fā)現(xiàn)萊斯頓埃博拉能引起食蟹 猴發(fā)病和死亡，尚未有關(guān)人感染萊斯頓埃博拉致發(fā)病的報(bào)道，但是非人靈長類作為重要的 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一旦感染萊斯頓埃博拉病毒，不僅會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成影響，還很有可能感染我國 野生靈長類動(dòng)物。由于目前全球還沒有可大規(guī)模使用的治療埃博拉出血熱的特效藥物，也 沒有可預(yù)防埃博拉病毒感染的有效疫苗，因此，在進(jìn)口檢疫過程中，特別是對(duì)于從非洲進(jìn)口 的動(dòng)物，須嚴(yán)格做好檢疫排查工作，尤其要嚴(yán)防萊斯頓型埃博拉病毒疫情傳入我國。
[0004] 實(shí)驗(yàn)室早期診斷對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)病患及時(shí)采取防控措施有重要意義。埃博拉病毒的 實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)和血清學(xué)檢測。但血清學(xué)檢查耗時(shí)過長，這一缺陷限制 了其在臨床上的快速診斷?？乖闹苯訖z測包括了對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白以及核酸的檢測。其 中，病毒結(jié)構(gòu)蛋白的檢測基于抗原抗體的反應(yīng)、偶聯(lián)酶或者化學(xué)生色原或者熒光染料，包括 免疫焚光（lmmunofluorescence，IF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)，直接或間接免疫熒光試驗(yàn)的敏感度波動(dòng)在40%?100%，特異性在86%? 99 %，但是由于需要熒光顯微鏡特殊儀器而限制了其在臨床上的應(yīng)用。
[0005] 目前對(duì)埃博拉病毒抗原核酸的最優(yōu)檢測手段是實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Real-time PCR)，它將高靈敏性、高特異性和高準(zhǔn)確性結(jié)為一體，克服了傳統(tǒng)PCR費(fèi)時(shí)、易 污染、低通量等缺點(diǎn)，可對(duì)樣本中的埃博拉病毒核酸進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測。但目前尚未有關(guān) 于埃博拉病毒萊斯頓亞型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的方法及試劑盒的報(bào)道。因此，提供高 靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性的萊斯頓埃博拉病毒的Real-time PCR檢測引物，實(shí)現(xiàn)對(duì)萊斯頓埃 博拉的快速準(zhǔn)確檢測具有十分重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種高靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性的埃 博拉病毒萊斯頓亞型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測引物對(duì)及試劑盒。
[0007] 本發(fā)明提供了一種埃博拉病毒萊斯頓亞型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)，包括：具 有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游引物，和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游 引物。
[0008] 本發(fā)明提供的引物對(duì)擴(kuò)增出目的基因片段大小為161bp。
[0009] 本發(fā)明提供的引物對(duì)的退火溫度為64°C。
[0010] 本發(fā)明以埃博拉病毒萊斯頓亞型的保守基因 NP基因（核殼蛋白基因）作為檢測 靶目標(biāo)。通過分析埃博拉病毒萊斯頓亞型、扎伊爾型、蘇丹型、本迪布焦型、塔伊森林亞型的 NP基因全序列，篩選出萊斯頓亞型的保守序列，并據(jù)此設(shè)計(jì)real-time PCR引物。以該引物 對(duì)進(jìn)行埃博拉病毒萊斯頓亞型的檢測能夠具有良好的準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度。本發(fā)明通 過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以該引物對(duì)對(duì)萊斯頓亞型埃博拉病毒進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確性可達(dá)100%，對(duì)其他亞 型病毒或其他種類病毒進(jìn)行檢測，未見非特異性擴(kuò)增，特異性良好，通過對(duì)不同拷貝的病毒 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后檢測，該引物對(duì)對(duì)病毒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測濃度可達(dá)10° C〇pieS/μ L，具有良好的 靈敏性。在標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線中，不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品間線性關(guān)系（R2)達(dá)0.997,斜 率介于-3.0至-3. 5之間，為-3. 101，擴(kuò)增效率為110. 145%，在熔解曲線中，所有標(biāo)準(zhǔn)品均 在79. 94°C出現(xiàn)尖且窄的特異性熔解峰。將熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，特異性 條帶亮度隨模板拷貝數(shù)梯度降低而等倍下降。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種埃博拉病毒萊斯頓亞型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，包 括：具有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游引物，和具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的 下游引物。
[0012] 本發(fā)明提供的試劑盒還包括：PCR反應(yīng)試劑和SYBR Green試劑。
[0013] 作為優(yōu)選，PCR反應(yīng)試劑包括：dNTP、Taq酶、PCR反應(yīng)緩沖液和MgCl2。
[0014] 本發(fā)明提供的試劑盒還包括水、96孔板和光學(xué)反應(yīng)蓋膜。
[0015] 本發(fā)明提供的試劑盒用于對(duì)包含或不包含埃博拉病毒萊斯頓亞型病毒的待測樣 品的檢測。在本發(fā)明實(shí)施例中，包含埃博拉病毒萊斯頓亞型病毒的待測樣品的制備方法為： 將埃博拉病毒萊斯頓亞型的NP基因片段克隆至pcDNA3. 1(+)載體，為待測樣品；或者將載 有埃博拉病毒萊斯頓亞型的NP基因片段的pcDNA3. 1(+)載體與動(dòng)物組織或分泌物混合，為 待測樣品。
[0016] 所述埃博拉病毒萊斯頓亞型的NP基因片段的制備方法為：以NP基因的全長序列 為模板，以SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列 的下游引物擴(kuò)增。
[0017] 所述NP基因的全長序列來自Genbank，登錄號(hào)為AF522874. 1。
[0018] 本發(fā)明提供的試劑盒的使用方法包括以下步驟：以待測樣品的cDNA為模板，以 SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游引物， 經(jīng)real-time PCR檢測，獲得病毒載量。
[0019] 病毒載量的獲得方法為，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得Ct值對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)，計(jì)算得到病毒載 量。
[0020] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法為：計(jì)算好拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋，從 lX109copies/y 1稀釋至lX10°copies/y 1作為模板，以SEQ ID N0:1?2所示序列的引 物，經(jīng)real-time PCR檢測，獲得各拷貝標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)Ct值，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱 坐標(biāo)，繪制曲線。
[0021] 病毒載量的計(jì)算公式為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種埃博拉病毒萊斯頓亞型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)，包括：具有SEQIDNO: 1所 示核苷酸序列的上游引物，和具有SEQIDN0:2所示核苷酸序列的下游引物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其特征在于，其退火溫度為64°C。
3. -種埃博拉病毒萊斯頓亞型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，包括：具有SEQID NO: 1所示核苷酸序列的上游引物，和具有SEQIDN0:2所示核苷酸序列的下游引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括：PCR反應(yīng)試劑和SYBR Green試 劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)試劑包括：dNTP、Taq酶、 PCR反應(yīng)緩沖液和MgCl2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括水、96孔板和光學(xué)反應(yīng)蓋膜。
7. 如權(quán)利要求3?6任一項(xiàng)所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：以 待測樣品的cDNA為模板，以SEQIDN0:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDN0:2 所示核苷酸序列的下游引物，經(jīng)real-timePCR檢測，獲得病毒載量。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述SEQIDNO: 1所示核苷酸序列 的上游引物的濃度為l〇ymol/L;所述SEQIDN0:2所示核苷酸序列的上游引物的濃度為 10ymol/L〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述real-timePCR檢測的程序?yàn)椋?br>10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述real-timePCR檢測的體系 為：
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及埃博拉病毒萊斯頓亞型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測引物對(duì)及試劑盒。該引物對(duì)包括：具有SEQ？ID？NO:1所示核苷酸序列的上游引物，和具有SEQ？ID？NO:2所示核苷酸序列的下游引物。本發(fā)明還提供了包括該引物對(duì)的試劑盒和該試劑盒的使用方法。采用本發(fā)明提供的引物對(duì)對(duì)埃博拉病毒萊斯頓亞型進(jìn)行檢測能夠具有良好的準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明提供的的引物的準(zhǔn)確性可達(dá)100％，特異性良好，最低檢測濃度低至100copies/μL。因此，采用包含該引物對(duì)的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)包含或不包含埃博拉病毒萊斯頓亞型的樣品的快速、準(zhǔn)確檢測。
【IPC分類】C12R1-93, C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104561321
【申請?zhí)枴緾N201510014997
【發(fā)明人】許黎黎, 谷松至, 鮑琳琳, 秦川
【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月12日