一種新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白的高效表達法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白一水蛭素12肽和瑞普替酶融合蛋白(HV12p-rPA)在pET21a-HrP/BL21大腸桿菌工程菌中的高效表達方法。
【背景技術(shù)】
[0002]本發(fā)明中的高效表達目標為水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p_rPA)，是通過一個(Gly)3柔性肽基團將重組水蛭素HV3的C末端12肽與rPA基因融合而成的一種同時具有抗凝溶栓雙功能的全新蛋白(專利號:ZL 2006 I 0022457.8)。該蛋白通過目前最常用的表達系統(tǒng)一大腸桿菌進行表達，其表達水平的高低直接影響后續(xù)的研究及其產(chǎn)業(yè)化的進展，但該融合蛋白在大腸桿菌中的表達量很低，韋利軍等在“抗凝、溶栓雙功能水蛭素12肽一瑞替普酶融合蛋白的模擬、構(gòu)建與表達”([J].藥物生物技術(shù)，2007，14 (3):168-172)中得到的HV12p-rPA融合蛋白的表達量約占全菌總蛋白的12%。蛋白表達量過低，不僅加大了后續(xù)分離純化等工作的研究難度，且限制了該蛋白在藥物研究與開發(fā)方面的應(yīng)用潛力。因此，選用適當?shù)姆椒êY選優(yōu)化工程菌發(fā)酵條件，建立一套完善的目標蛋白高表達的方案將十分必要。
[0003]目前，已有很多文獻針對第三代溶栓藥r-PA的表達進行了報道，如，孔揚在“重組組織型纖溶酶原激活劑變異體工程菌的培養(yǎng)與體外復(fù)性的研究”([D].山東:山東大學(xué)微生物學(xué)系，2005.)中，構(gòu)建了 E.coli PTPA3/BL21，并通過單因素法優(yōu)化其培養(yǎng)條件，表明40°C、200rpm、20-40ummol/l的IPTG誘導(dǎo)4_5h，可表達得到rPA約占細胞總蛋白的36.2%。趙友春等在“組織型纖溶酶原激活劑重組變異體Reteplase的克隆表達和分離純化”([J].山東大學(xué)學(xué)報工學(xué)版，2003，33 (2):216-220)中，構(gòu)建了大腸桿菌工程菌pTPA3/BL21，該菌種在37°C、lmmol/1的IPTG誘導(dǎo)4h，表達的r_PA占菌體蛋白的40%。孫雄華等在“瑞替普酶在大腸桿菌中的表達與活性測定”([J].中國血液流變學(xué)雜志，2006，16 (4) =534-536)中，成功在大腸桿菌中表達了帶組氨酸標簽的r-PA，但其目的在于簡化下游分離純化步驟，而非提聞目標蛋白表達廣率，因而于180rpm、lmmol/1的IPTG誘導(dǎo)5h,表達后電泳僅可見目標蛋白條帶，表達量未報道。王偉等在“瑞替普酶融合蛋白的表達、純化及分子伴侶對其復(fù)性的影響”([J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013,48 (11):1287-1291)中，成功構(gòu)建了工程菌 PET-32a-r-PA/ BL21，并在 37°C、150_250rpm、0.5umol/l 的 IPTG 誘導(dǎo) 3h 條件下實現(xiàn)了r-PA的表達，表達量未說明。
[0004]本項發(fā)明在前期工作中已成功構(gòu)建了大腸桿菌HV12p_rPA /BL21工程菌。經(jīng)發(fā)酵、誘導(dǎo)后，獲得HV12p-rPA融合蛋白。該融合蛋白以包涵體的形式存在于大腸桿菌細胞中，經(jīng)復(fù)性及純化、體外生物學(xué)活性檢測及動物體內(nèi)藥效研究后，已被證實具有抗凝、溶栓雙重功能。因此，該融合蛋白在研發(fā)成為兼具抗凝溶栓雙重功能的新一代抗血栓藥方面具備巨大的潛力。但鑒于HV12p-rPA是一種全新的、兼具抗凝溶栓雙功能的融合蛋白，目前還沒有文獻對其高表達條件進行研究和報道。采用上述文獻中的表達條件進行該新型蛋白的表達，均不能獲得聞表達結(jié)果。
[0005]基因工程菌細胞高密度培養(yǎng)是獲得高產(chǎn)量外源蛋白的一種重要策略。大腸桿菌是多種重組蛋白表達時的首選宿主，篩選優(yōu)化大腸桿菌發(fā)酵條件的常用方法有單因素法、正交法、響應(yīng)面法等。單因素法耗時長，操作中偶然因素影響大，此外，各因素間的交互作用無法考察，致使試驗結(jié)果的準確度較低；正交法可篩選多水平多因素中的較優(yōu)條件組合，但由于無法擬合影響因素與響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，不能對所有因素進行面分析，故一般難以得到最優(yōu)條件；響應(yīng)面法則試驗次數(shù)少，周期短，既可充分考察各因素間的交互作用，也可通過解析回歸方程求出最優(yōu)參數(shù)值，大大提高了實驗的精確度，可彌補以上優(yōu)化方法的不足。本發(fā)明同時采用上述這些篩選手段對HV12p-rPA這種嶄新的蛋白進行高效表達條件的研究，建立了 HV12p-rPA到目前為止表達量達36%的高效方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌高效表達新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白一水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的方法，如下:
以體積比1%的接種量，將15%甘油管保存的、含有HV12p-rPA融合基因的pET21a_HrP/BL21大腸桿菌工程菌菌種接種至含100ug/ml Amp的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，200rpm條件下，培養(yǎng)12h，使菌種得到活化，然后向培養(yǎng)基中加入0.5-1.5 mmol/L CaCl2*20mmol/L皿8(:12至少一種，再以體積比5%接種量加入活化菌液，于37-39°C，180-220rpm下發(fā)酵培養(yǎng)3h，最后加入終濃度為lmmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，37_39°C和180_220rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4h，結(jié)束后，收菌，即4°C下以8000rpm離心3min，所得菌體沉淀以PBS (pH7.4)吹勻洗滌一次后，同條件離心得菌體，超聲破菌后獲得表達量為20-36%的目標蛋白。
[0007]采用正交法結(jié)合響應(yīng)面法對含有HV12p-rPA融合基因的pET21a_HrP/BL21大腸桿菌工程菌培養(yǎng)條件進行篩選及優(yōu)化，確立了發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件，即溫度38.06°C，轉(zhuǎn)速207.84 rpm, Ca2+濃度 1.05 mmol/L,最佳平均表達量為 36.15%。
[0008]上述重組大腸桿菌高效表達水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)階段，通過控制轉(zhuǎn)速間接控制通氧量，使培養(yǎng)基中的重組大腸桿菌大量繁殖，縮短了發(fā)酵周期。在誘導(dǎo)階段，適當提高培養(yǎng)溫度，既促進菌體生長，又有利于提高工程菌的表達量。該方法的優(yōu)點在于易于操作、工藝簡單，且表達量高、成本相對低，具有良好應(yīng)用價值。
[0009]【具體實施方式】:
實施例一:
1.重組大腸桿菌工程菌表達水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法:
①搖瓶發(fā)酵:用蒸懼水新鮮配制LB液體培養(yǎng)基,加入100ug/ml的Amp溶液,再以1%的接種量，將15%甘油管保存的菌種接種至培養(yǎng)基中，37 °C、200rpm培養(yǎng)12h，使菌種得到活化。再將此活化的菌液按5%的接種量轉(zhuǎn)接至搖瓶中，搖瓶內(nèi)為蒸餾水配制的LB培養(yǎng)基，其中含 Ampl00ug/ml, Ca2+ lmmol/L、Mg2+20mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng) 3h 后，加 1.Smmol /T, IPTG 作為誘導(dǎo)劑，39°C、200rpm 誘導(dǎo) 4h。
[0010]②收菌:誘導(dǎo)結(jié)束后，于4°C條件下，以8000rpm離心3min,所得菌體沉淀以PBS(pH7.4)吹勻洗滌一次后，同條件離心得菌體。
[0011]③菌體的破碎:以Tris-Cl (pH 8.0)重懸菌體，250W，5sX 10s，冰浴超聲累計5min, 12000rpm, 4°C離心 20min 得包涵體，-20°C保存。
[0012]2.結(jié)果鑒定:所得包涵體蛋白經(jīng)12%SDS_PAGE電泳后，以考馬斯亮藍R-250染色，脫色后進行掃描，所得目的蛋白在菌體總蛋白中的表達量為31%。
[0013]實施例二:
1.重組大腸桿菌工程菌表達水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法:
①搖瓶發(fā)酵:用蒸懼水新鮮配制LB液體培養(yǎng)基,加入100ug/ml的Amp溶液,再以1%的接種量，將15%甘油管保存的菌種接種至培養(yǎng)基中，37 °C、200rpm培養(yǎng)12h，使菌種得到活化。再將此活化的菌液按5%的接種量轉(zhuǎn)接至搖瓶中，搖瓶內(nèi)為蒸餾水配制的LB培養(yǎng)基，其中含 AmplOOug/ml, Ca2+ lmmol/L、Mg2+20mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng) 3h 后,加 lmmol/L IPTG 作為誘導(dǎo)齊[1，381:、200印111誘導(dǎo) 4h。
[0014]②收菌:誘導(dǎo)結(jié)束后，于4°C條件下，以8000rpm離心3min,所得菌體沉淀以PBS(pH7.4)吹勻洗滌一次后，同條件離心得菌體。
[0015]③菌體的破碎:以Tris-Cl (pH 8.0)重懸菌體，250W，5sX 10s，冰浴超聲累計5min, 12000rpm, 4°C離心 20min 得包涵體，-20°C保存。
[0016]2.結(jié)果鑒定:所得包涵體蛋白經(jīng)12%SDS_PAGE電泳后，以考馬斯亮藍R-250染色，脫色后進行掃描，所得目的蛋白在菌體總蛋白中的表達量為36%。
[0017]實施例三:
1.重組大腸桿菌工程菌表達水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法:
①搖瓶發(fā)酵:用蒸懼水新鮮配制LB液體培養(yǎng)基,加入100ug/ml的Amp溶液,再以1%的接種量，將15%甘油管保存的菌種接種至培養(yǎng)基中，37 °C、200rpm培養(yǎng)12h，使菌種得到活化。再將此活化的菌液按5%的接種量轉(zhuǎn)接至搖瓶中，搖瓶內(nèi)為蒸餾水配制的LB培養(yǎng)基，其中含 AmplOOug/ml, Ca2+ 1.0SmmoI /I,、Mg2+20mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng) 3h 后，加 lmmol/L IPTG 作為誘導(dǎo)劑，38.060C >207.84rpm 誘導(dǎo) 4h。
[0018]②收菌:誘導(dǎo)結(jié)束后，于4°C條件下，以8000rpm離心3min,所得菌體沉淀以PBS(pH7.4)吹勻洗滌一次后，同條件離心得菌體。
[0019]③菌體的破碎:以Tris-Cl (pH 8.0)重懸菌體，250W，5sX 10s，冰浴超聲累計5min, 12000rpm, 4°C離心 20min 得包涵體，-20°C保存。
[0020]2.結(jié)果鑒定:所得包涵體蛋白經(jīng)12%SDS_PAGE電泳后，以考馬斯亮藍R-250染色，脫色后進行掃描，所得目的蛋白在菌體總蛋白中的表達量為36.15%。
【主權(quán)項】
1.一種高效表達新型抗凝溶栓雙功能水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法，其表達條件為:將終濃度為ΙΟΟμ g/ml的Amp+溶液加入到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，以體積比1%的接種量將含有HV12p-rPA融合基因的pET21a_HrP/BL21大腸桿菌工程菌菌種接種至培養(yǎng)基中，于37°C，200rpm條件下，培養(yǎng)12h，使菌種得到活化，然后向培養(yǎng)基中加入0.5-1.5 mmol/L CaCl2* 20mmol/L MgCl 2至少一種,再以體積比5%接種量加入活化菌液，于37-39°C，180-220rpm下發(fā)酵培養(yǎng)3h，最后加入終濃度為ImmoI/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，37-39°C和180-220rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4h，獲得表達量為20-36%的目標蛋白。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:培養(yǎng)重組大腸桿菌的最優(yōu)溫度為38.060C，最佳轉(zhuǎn)速為207.84 rpm，最佳Ca2+濃度為1.05 mmol/L,最佳表達量為36.15%。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及到一種新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白-水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白（HV12p-rPA）的高效表達法。本方法篩選優(yōu)化了大腸桿菌工程菌搖瓶培養(yǎng)條件中的七個主要因素（培養(yǎng)基的配制、接種量、誘導(dǎo)時間、轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)溫度、補料方式、微量元素），確定出影響目標蛋白表達量的三個最重要因素為轉(zhuǎn)速、溫度及鈣離子濃度，并使目標蛋白HV12p-rPA的表達量達到36.15%。本法簡單、易行、高效，成本相對低，具有良好應(yīng)用價值。
【IPC分類】C07K14-815, C12R1-19, C12N9-64
【公開號】CN104593343
【申請?zhí)枴緾N201510017906
【發(fā)明人】余蓉, 劉立平, 許小楓, 鄧璇
【申請人】四川大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月14日