一種邵伯雞鑒定用引物及其應(yīng)用和快速鑒定邵伯雞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及邵伯父母代和商品代的鑒定，具體涉及一種利用PCR技術(shù)快速鑒定邵伯雞的方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]邵伯雞配套系由江蘇省家禽科學(xué)研究所主持進行攻關(guān)，通過在我國優(yōu)質(zhì)地方雞種中導(dǎo)入dw基因，在國內(nèi)外首次育成矮小型青腿麻羽優(yōu)質(zhì)肉雞品系(S2系)并參與配套。該配套系已通過國家級品種(配套系)審定(農(nóng)09新品種證字第12號)，是具有自主知識產(chǎn)權(quán)的首個國家級優(yōu)質(zhì)肉雞配套系。經(jīng)鑒定，該項技術(shù)成果達國際先進水平。性連鎖矮小基因(dw)是生長激素受體(GHR)基因缺陷型，Dw基因是位于Z染色體上的伴性遺傳基因，處于肝臟壞死基因in位點和無翼基因we位點之間，靠近銀色(S)、金色(s)羽基因和慢羽(K)、快羽(k)基因。正?；駾W對dw為顯性，因此只有矮小型純合型公雞和攜帶矮小型基因的母雞表現(xiàn)出矮小性狀。dw和DW為不完全等位基因，dw基因同時具有質(zhì)量性狀基因和數(shù)量性狀基因的特性，矮小型雞是雞純合型性連鎖矮小基因(dw)的表型，具有個體小、耗料少、基礎(chǔ)代謝低、產(chǎn)蛋率高、飼養(yǎng)密度大、飼料報酬高、節(jié)約成本等優(yōu)點。
[0003]邵伯雞配套系與同類雞種相比，邵伯雞種雞開產(chǎn)日齡提前10%、產(chǎn)蛋性能提高20%、每只種雞節(jié)省飼料25%以上，邵伯雞配套系商品代為青腿麻羽、體貌美觀；性早熟，肉質(zhì)好，適應(yīng)性強，既能在丘陵地區(qū)放養(yǎng)，也適應(yīng)于規(guī)?；\養(yǎng)；市場接受程度高，售價高15?20%左右，飼養(yǎng)綜合效益可提高10%?15%以上。市場應(yīng)用前景十分廣闊，多地出現(xiàn)假冒邵伯雞出售的現(xiàn)象，需要簡單快捷的方法加以鑒定。
[0004]PCR技術(shù)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，被廣泛地運用在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的實驗室，例如用于判斷檢體中是否會表現(xiàn)某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因復(fù)制以及親子鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種邵伯雞鑒定用引物及其應(yīng)用和快速鑒定邵伯雞的方法，本發(fā)明利用性連鎖矮小基因(dw)不同擴增條帶大小，鑒別不同真?zhèn)紊鄄u，該方法不受環(huán)境影響，具有操作簡單、檢測快速、結(jié)果準確、通用性強、成本低廉等優(yōu)點。
[0006]本發(fā)明提供了一種引物，包括引物Fl和引物F2，
所述引物 Fl 上游引物 F:5，-tcccagactacacttctattca-3，；
所述引物 Fl 下游引物 R:5’ -cgggacagatcaaagacaatac-3’ ；
所述引物 F2 上游引物 F:5，-acctccaaagaaatctgtcgag-3，；
所述引物 F2 上游引物 R:5，-tggccaaatcctgaagtcct-3，。
[0007]本發(fā)明還提供了上述引物作為邵伯雞種質(zhì)資源的分子鑒定標(biāo)記的應(yīng)用。
[0008]此外，本發(fā)明又提供了一種快速鑒定邵伯雞的方法，以受測雞種的血液提取的DNA基因組為模板，用權(quán)利要求1所述引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，根據(jù)條帶判斷是否含有DW和/或dw基因，DW基因雞僅擴增出417 bp單一條帶；只含有dw基因雞僅擴增出217 bp單一條帶；含有DW和dw基因雞擴增出417 bp和217 bp兩個條帶；父母代父系僅有417bp條帶，父母代母系僅有217bp條帶，商品代有417 bp和217 bp兩個條帶。所述PCR擴增產(chǎn)物中僅出現(xiàn)417 bp單一條帶或217 bp單一條帶的，為假邵伯商品雞。
[0009]所述PCR擴增的反應(yīng)體系為20 UL，所述反應(yīng)體系由以下成分組成:10XPCRBuffer 2.0 μ L, Mg2+ 2.2 μ L, dNTP Mixture 0.8 μ L, TacfMk 聚合酶(5 U/ μ L ) 0.2μ L，所述引物Fl和引物F2的上、下游引物各I yL，cDNA模板I μ L，ddH20 9.8 μ L0
[0010]所述PCR擴增的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5 min ;95°C變性30 s，61.4°C退火30s，72°C延伸30 s，30個循環(huán)；72°C延伸8 min ;4°C保存。
[0011]所述瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟為:取5 UL PCR擴增產(chǎn)物與I yL 6XLoadingBuffer混合后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳120 V電壓下20 min,凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
第一，本發(fā)明提取待測樣本的雞基因組DNA，PCR擴增父母代父系僅有417bp條帶，父母代母系僅有217bp條帶，商品代有417 bp和217 bp兩個條帶，鑒別真?zhèn)紊鄄u。本發(fā)明是直接以受測雞種的血液提取的DNA基因組為模板，利用PCR技術(shù)檢測出dw基因的片段大小。本發(fā)明的優(yōu)越性體現(xiàn)在:操作簡單、檢測快速、結(jié)果準確、通用性強、成本低廉等優(yōu)點；第二，本發(fā)明公開了矮小基因(dw)作為邵伯雞父母代、商品代的分子鑒別標(biāo)記的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明包括:dw基因PCR擴增的上下游引物混合物和PCR反應(yīng)試劑。PCR反應(yīng)試劑為lOXbuffer，dNTP, rTaq酶。本發(fā)明包括DW基因PCR擴增的上下游引物混合物，PCR所需試劑。本發(fā)明方法效果顯著，檢測方法簡單快捷，且不受外界環(huán)境的影響。本發(fā)明應(yīng)用于邵伯雞品種鑒定，主要用于邵伯雞祖代、父母代和商品代的鑒定，本發(fā)明設(shè)計合理，使用方便、結(jié)果可靠且成本低廉。
【附圖說明】
[0014]圖1是父母代父系公雞的擴增圖；
圖2是父母代母系母雞的擴增圖；
圖3是商品代的擴增圖。
【具體實施方式】
[0015]一種引物，包括引物Fl和引物F2，
所述引物 Fl 上游引物 F:5，-tcccagactacacttctattca-3?；
所述引物 Fl 下游引物 R:5’ -cgggacagatcaaagacaatac-3’ ；
所述引物 F2 上游引物 F:5，-acctccaaagaaatctgtcgag-3，；
所述引物 F2 上游引物 R:5，-tggccaaatcctgaagtcct-3，。
[0016]上述引物作為邵伯雞種質(zhì)資源的分子鑒定標(biāo)記的應(yīng)用。
[0017]一種快速鑒定邵伯雞的方法，其特征是，以受測雞種的血液提取的DNA基因組為模板，用權(quán)利要求1所述引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，根據(jù)條帶判斷是否含有DW和/或dw基因，Dff基因雞僅擴增出417 bp單一條帶；只含有dw基因雞僅擴增出217 bp單一條帶；含有DW和dw基因雞擴增出417 bp和217 bp兩個條帶；父母代父系僅有417bp條帶，父母代母系僅有217bp條帶，商品代有417 bp和217 bp兩個條帶。PCR擴增產(chǎn)物中僅出現(xiàn)417 bp單一條帶或217 bp單一條帶的,為假邵伯商品雞。
[0018]PCR擴增的反應(yīng)體系為20 μ L，所述反應(yīng)體系由以下成分組成:10 X PCR Buffer2.0 μ L, Mg2+ 2.2 μ L, dNTP Mixture 0.8 μ L, TacfMk 聚合酶(5 U/ μ L ) 0.2 μ L，所述引物Fl和引物F2的上、下游引物各I yL，cDNA模板I μ L，ddH20 9.8 μ L0
[0019]PCR擴增的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5 min ;95°C變性30 s，61.4°C退火30 S，72°C延伸30 S，30個循環(huán)；72°C延伸8 min ;4°C保存。
[0020]瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟為:取5 yL PCR擴增產(chǎn)物與I μ L 6 X Loading Buffer混合后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳120 V電壓下20 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[0021]實施例1
1、試驗材料
實驗所用邵伯雞來自江蘇省家禽科學(xué)研究所，10只矮小型父母代母系公雞(Zdw zdw)、10只雜合子商品代公雞(ZDw Zdw)、10只正常型父母代父系公雞(Zdw ZDw)、10只矮小型母系母雞(Zdw W)、10只正常型父系雞母雞(Zdw W)，所有雞翅靜脈采血，肝素鈉抗凝。
[0022]2、操作步驟
PCR 擴增:PCR 擴增體系為 20 yL:10XPCR Buffer 2.0 μ L, Mg2+ 2.2 μ L，dNTPMixture 0.8 μ L，T^DNA 聚合酶(5 U/μ L ) 0.2 μ L，F(xiàn)1 和 F2 上、下游引物各 I yL，cDNA模板 I μ L，ddH20 9.8 μ L0 反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性 5 min ;95°C變性 30 s，61.4°C退火 30s，72°C延伸30 s，30個循環(huán)；72°C延伸8 min ;4°C保存。
[0023]瓊脂糖凝膠電泳檢測:取5 UL PCR擴增產(chǎn)物與I μ L 6 X Loading Buffer混合后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳120 V電壓下20 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[0024]3、結(jié)果
矮小型父母代母系公雞擴增圖如圖2所示，雜合子商品代公雞擴增圖如圖3所示、父母代父系公雞擴增圖如圖1所示、矮小型母系母雞擴增圖如圖2所示、I正常型父系雞母雞擴增圖如圖1所示。由此可見，PCR擴增片段大小可作為邵伯雞品種鑒定的方法。
【主權(quán)項】
1.一種引物，其特征是，所述引物包括引物Fl和引物F2， 所述引物 Fl 上游引物 F:5，-tcccagactacacttctattca-3，； 所述引物 Fl 下游引物 R:5’ -cgggacagatcaaagacaatac-3’ ； 所述引物 F2 上游引物 F:5，-acctccaaagaaatctgtcgag-3，； 所述引物 F2 上游引物 R:5，-tggccaaatcctgaagtcct-3，。
2.如權(quán)利要求1所述的引物作為邵伯雞種質(zhì)資源的分子鑒定標(biāo)記的應(yīng)用。
3.一種快速鑒定邵伯雞的方法，其特征是，以受測雞種的血液提取的DNA基因組為模板，用權(quán)利要求1所述引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，根據(jù)條帶判斷是否含有DW和/或dw基因，Dff基因雞僅擴增出417 bp單一條帶；只含有dw基因雞僅擴增出217 bp單一條帶；含有DW和dw基因雞擴增出417 bp和217 bp兩個條帶；僅有417bp條帶為父母代父系，僅有217bp條帶為父母代母系，有417 bp和217 bp兩個條帶為商品代；所述PCR擴增產(chǎn)物中僅出現(xiàn)417 bp單一條帶或217 bp單一條帶的，為假邵伯商品雞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速鑒定邵伯雞的方法，其特征是，所述PCR擴增的反應(yīng)體系為20 μ L，所述反應(yīng)體系由以下成分組成:10 X PCR Buffer 2.0 μ L7Mg2+ 2.2 μ L, dNTPMixture 0.8 μ L,5 U/μ L聚合酶0.2 μ L，所述引物Fl和引物F2的上、下游引物各 I μ L，cDNA 模板 I μ L, ddH20 9.8 μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速鑒定邵伯雞的方法，其特征是，所述PCR擴增的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性 5 min;95°C變性 30 s，61.4°C退火 30 s，72°C延伸 30 s，30 個循環(huán)；72°C延伸8 min ;4°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速鑒定邵伯雞的方法，其特征是，所述瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟為:取5 μ L PCR擴增產(chǎn)物與I μ L 6 X Loading Buffer混合后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳120 V電壓下20 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。
【專利摘要】一種引物，包括引物F1和引物F2，引物F1和引物F2的核苷酸序列如序列表所示。本發(fā)明還提供了上述引物作為邵伯雞種質(zhì)資源的分子鑒定標(biāo)記的應(yīng)用。此外，本發(fā)明又提供了一種快速鑒定邵伯雞的方法，以受測雞種的血液提取的DNA基因組為模板，用上述引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，根據(jù)條帶判斷是否含有DW和/或dw基因，DW基因雞僅擴增出417 bp單一條帶；只含有dw基因雞僅擴增出217 bp單一條帶；含有DW和dw基因雞擴增出417 bp和217 bp兩個條帶。本發(fā)明利用性連鎖矮小基因（dw）不同擴增條帶大小，鑒別不同真?zhèn)紊鄄u，該方法不受環(huán)境影響，具有操作簡單、檢測快速、結(jié)果準確、通用性強、成本低廉等優(yōu)點。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104593358
【申請?zhí)枴緾N201410796811
【發(fā)明人】趙振華, 黎泰豐, 張晶鑫, 黃華云, 李春苗, 王錢保, 吳兆林, 陳聯(lián)頤
【申請人】江蘇省家禽科學(xué)研究所
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年12月22日