一種低分子量蜂花粉蛋白肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種低分子量蜂花粉蛋白肽及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 花粉是植物的雄性細(xì)胞，是植物的"精子"。蜜蜂采集回巢的花粉，稱為蜂花粉。蜂 花粉中除含有一般花粉的成分外，還含有蜜蜂在采集進(jìn)加進(jìn)去的少量花粉蜜與分泌物，因 此蜂花粉與一般花粉的成分略有差異。其外觀形狀也不同于粉末狀的花粉粒，而是經(jīng)蜜蜂 加工過(guò)的多為扁圓形的花粉團(tuán)?；ǚ哿Ｖ睆蕉嘣?0 - 50微米之間，花粉粒表面有各種不 規(guī)則的溝紋，并有明顯的萌發(fā)孔。
[0003] 現(xiàn)有蜂花蛋白肽主要是通過(guò)酶解花粉而獲得，如以蜂花粉為原料，將蜂花粉破 壁、脫脂，加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，所得酶解物具有抗氧化等作用，可制成粉劑、片劑、膠 囊、沖劑等。但這種酶解產(chǎn)物產(chǎn)率低，蛋白功效較差，而且較易引起過(guò)敏。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明第一目的是提供一種低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，所得蜂花粉蛋白 肽分子量低、色澤均一，可用于食品、藥品、化妝品和保健品中。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] -種低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，包括以下步驟：
[0007] 1)將破壁蜂花粉加入稀鹽酸溶液中，再加入胃蛋白酶，35_38°C下反應(yīng)3?5h，得 到體系1 ;
[0008] 2)將體系1的pH值調(diào)至6.0?8.0,加入中性蛋白酶，48-51°C反應(yīng)2?3h，得到 體系2 ;
[0009] 3)維持體系2的pH值不變，加入菠蘿蛋白酶，53-56 °C反應(yīng)3?5h，再升溫至 88-90°C，維持10?20min，得到體系3 ;
[0010] 4)將體系3進(jìn)行抽濾（抽濾膜孔徑0.45pm)，所得濾液經(jīng)脫苦脫色、真空濃縮、噴 霧干燥，得到蜂花粉蛋白肽。
[0011] 本發(fā)明通過(guò)胃蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶三步酶解法，對(duì)破壁蜂花粉進(jìn)行酶 解，可以獲得分子量在3000Da以下的低分子量蜂花粉蛋白肽。
[0012] 其中，所述破壁蜂花粉與稀鹽酸的質(zhì)量體積比為1 :5?15 (g/mL)，所述稀鹽酸質(zhì) 量體積百分?jǐn)?shù)為〇. 2?0. 4% ;
[0013] 其中，所述胃蛋白酶的活力單位為2500?4000u/g;胃蛋白酶：破壁蜂花粉的質(zhì)量 比為 0? 25 ?0? 3:100 ;
[0014] 其中，所述中性蛋白酶的活力單位為3萬(wàn)?6萬(wàn)u/g;中性蛋白酶：破壁蜂花粉的 質(zhì)量比為〇? 45?0? 5:100 ;
[0015] 其中，所述菠蘿蛋白酶的活力單位為40萬(wàn)?80萬(wàn)u/g;蘿蛋白酶：破壁蜂花粉的 質(zhì)量比為0.8?1:100 ;
[0016] 其中，所述脫苦脫色是指在濾液中加入活性炭，室溫下攪拌l-3h后，過(guò)濾除去活 性碳的過(guò)程。
[0017] 作為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟4)中，體系3進(jìn)行抽濾（抽濾膜孔徑 0. 45ym)，所得濾液選用分子截留量為2kd的超濾膜進(jìn)行超濾，收集濾液，經(jīng)脫苦脫色、 真空濃縮、噴霧干燥，即得蜂花粉蛋白肽。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的超濾處理，可以獲得分子量小于 l〇〇〇Da的低分子量蜂花粉蛋白肽。
[0018] 本發(fā)明第二目的是提供上述制備方法所得的蜂花粉蛋白肽。
[0019] 采用本發(fā)明所述的技術(shù)方案制得的蜂花粉蛋白肽分子量低，抗氧化效果好，無(wú)異 味，可用于食品、藥品、化妝品和保健品中。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是本發(fā)明所述蜂花粉蛋白肽制備方法的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0022] 實(shí)施例1 一種低分子量蜂花粉蛋白肽制備
[0023] 步驟如下：
[0024] 1)取100克破壁蜂花粉加入1L濃度為0.3 %的稀鹽酸溶液中，再加入0.3克比活 為3500u/g的胃蛋白酶，37°C反應(yīng)3h，得到體系1;
[0025] 2)將體系lpH值調(diào)至6. 8,加入0. 5克比活為5萬(wàn)u/克的中性蛋白酶，升溫至50°C 繼續(xù)反應(yīng)2h，得到體系2;
[0026] 3)維持體系2pH值不變，加入0.8克比活為80萬(wàn)u/g的菠蘿蛋白酶，升溫至55°C 反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后，將體系升溫至90°C，保持15min，使酶滅活，得到體系3;
[0027] 4)體系3經(jīng)0. 45ym濾膜抽濾后，濾液直接經(jīng)脫苦脫色、真空濃縮后、噴霧干燥后 即得的低分子量蜂花粉蛋白肽。
[0028] 實(shí)施例2-種低分子量蜂花粉蛋白肽制備
[0029] 采用與實(shí)施例1相同的方法制備蜂花粉蛋白肽，區(qū)別在于：
[0030] 步驟4)體系3經(jīng)0.45ym濾膜抽濾后，濾液先經(jīng)過(guò)截留量為2kd的超濾膜進(jìn)行超 濾后，再將濾液進(jìn)行脫苦脫色、真空濃縮、噴霧干燥后得到低分子量蜂花粉蛋白肽。
[0031] 實(shí)施例3 -種低分子量蜂花粉蛋白肽制備
[0032] 步驟如下：
[0033] 1)取100克破壁蜂花粉，加入1.5L濃度為0.4%的稀鹽酸溶液中，再加入0.25克 比活為4000u/g的胃蛋白酶，37°C反應(yīng)5h，得到體系1;
[0034] 2)將體系lpH值調(diào)至7.0,加入0.45克比活為6萬(wàn)u/克的中性蛋白酶，升溫至 50°C繼續(xù)反應(yīng)3h，得到體系2;
[0035]3)維持體系2pH值不變，加入1克比活為80萬(wàn)u/g的菠蘿蛋白酶，升溫至55°C反 應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，將體系升溫至90C，保持15min，使酶滅活，得到體系3 ;
[0036] 4)體系3經(jīng)0. 45ym濾膜抽濾后，濾液直接經(jīng)脫苦脫色、真空濃縮后、噴霧干燥后 即得的低分子量蜂花粉蛋白肽。
[0037]實(shí)施例4 一種低分子量蜂花粉蛋白肽制備
[0038] 采用與實(shí)施例3相同的方法制備蜂花粉蛋白肽，區(qū)別在于：
[0039] 步驟4)體系3經(jīng)0. 45ym濾膜抽濾后，濾液先經(jīng)過(guò)截留量為2kd的超濾膜進(jìn)行超 濾，再將濾液進(jìn)行脫苦脫色、真空濃縮、噴霧干燥，得到低分子量蜂花粉蛋白肽。
[0040] 實(shí)驗(yàn)例1分子量測(cè)定
[0041] 測(cè)定方法：通過(guò)凝膠層析法測(cè)定分子量，試驗(yàn)過(guò)程中選用0.lmol/L的Tris-HCl洗 脫液平衡處理SPhedexG-25凝膠柱后，在220nm的波長(zhǎng)下，檢測(cè)濃度為2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)： 還原性谷胱甘肽（307Da)、縮宮素（1007Da)、胰高血糖素（348?a)、和胰島素（5808Da)，根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分子量對(duì)數(shù)和洗脫體積，擬合得回歸方程為：
[0042]y= -39. 865x+203. 53 (R2 = 0. 9917)
[0043] 其中，y為洗脫體積，x為相應(yīng)分子量的對(duì)數(shù)值。
[0044] 將實(shí)施1-4所得蛋白肽分別配制濃度為5mg/ml的溶液，在上述條件下分別進(jìn)樣洗 脫，將出峰體積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得樣品分子量及其分布范圍，通過(guò)峰面積歸一法，確定 不同分子量蛋白肽的相對(duì)百分含量，所得結(jié)果如表1所示。
[0045] 對(duì)照品：采用實(shí)施例4的方法制備蜂花粉蛋白酶，區(qū)別在于，將步驟1)、步驟3)蛋 白酶替換為堿性蛋白酶。
[0046] 表1不同樣品分子量分布
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1)將破壁蜂花粉加入稀鹽酸溶液中，再加入胃蛋白酶，35-38°C下反應(yīng)3?5h，得到體 系1 ; 2)將體系1的pH值調(diào)至6.0?8.0,加入中性蛋白酶，48-51°C反應(yīng)2?3h，得到體系 2 ； 3)維持體系2的pH值不變，加入菠蘿蛋白酶，53-56°C反應(yīng)3?5h，再升溫至88-90°C， 維持10?20min，得到體系3 ; 4) 將體系3進(jìn)行抽濾，所得濾液經(jīng)脫苦脫色、真空濃縮、噴霧干燥，得到蜂花粉蛋白肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，其特征在于，所述破壁 蜂花粉與稀鹽酸的質(zhì)量體積比為1 :5?15(g/mL)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，其特征在于，所述胃蛋 白酶的活力單位為2500?4000u/g。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，其特征在于，所述胃蛋 白酶：破壁蜂花粉的質(zhì)量比為0. 25?0. 3:100。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，其特征在于，所述中性 蛋白酶的活力單位為3萬(wàn)?6萬(wàn)u/g。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，其特征在于，所述中性 蛋白酶：破壁蜂花粉的質(zhì)量比為〇. 45?0. 5:100。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，其特征在于，所述菠蘿 蛋白酶的活力單位為40萬(wàn)?80萬(wàn)u/g。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，其特征在于，所述菠蘿 蛋白酶：破壁蜂花粉的質(zhì)量比為0.8?1:100。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法，其特征在于，所 述步驟4)中，體系3進(jìn)行抽濾，所得濾液選用分子截留量為2kd的超濾膜進(jìn)行超濾，收集濾 液，經(jīng)脫苦脫色、真空濃縮、噴霧干燥，即得蜂花粉蛋白肽。
10. 權(quán)利要求1-9任一所述低分子量蜂花粉蛋白肽的制備方法制得的蜂花粉蛋白肽。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種低分子量蜂花粉蛋白肽及其制備方法。所述低分子量蜂花粉蛋白肽按以下步驟制備而得：1)將破壁蜂花粉加入稀鹽酸溶液中，再加入胃蛋白酶，35-38℃下反應(yīng)3～5h，得到體系1；2)將體系1的pH值調(diào)至6.0～8.0，加入中性蛋白酶，48-51℃反應(yīng)2～3h，得到體系2；3)維持體系2的pH值不變，加入菠蘿蛋白酶，53-56℃反應(yīng)3～5h，再升溫至88-90℃，維持10～20min，得到體系3；4)將體系3進(jìn)行抽濾，所得濾液經(jīng)脫苦脫色、真空濃縮、噴霧干燥，得到蜂花粉蛋白肽。本發(fā)明所得蜂花粉蛋白肽分子量低，無(wú)異味，可用于食品、藥品、化妝品和保健品中。
【IPC分類】C12P21-06, C07K1-34
【公開(kāi)號(hào)】CN104593461
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410849370
【發(fā)明人】陳 光, 敖建芳, 劉銳濤
【申請(qǐng)人】唯美度科技（北京）有限公司
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2014年12月29日