納米抗體及其編碼序列和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)或生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種針對(duì)黃曲霉毒素B1納米 抗體及其編碼序列和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素是黃曲霉與寄生霉素產(chǎn)生毒株的代謝產(chǎn)物，它是化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的一 類(lèi)化合物，根據(jù)其結(jié)構(gòu)的差異分別被稱為黃曲霉毒素8 2、匕和62等，其中以黃曲霉毒 素&最為常見(jiàn)，也是已知最強(qiáng)的化學(xué)致癌物之一。黃曲霉毒素BJAflatoxinB1JFB1)是 二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌铮瑢?duì)人和若干動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒性，其毒性作用主要是對(duì)肝 臟的損害，人的原發(fā)性肝癌也很可能與黃曲霉毒素有關(guān)。早在1993年黃曲霉毒素B1就被 世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization,WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為1類(lèi)致癌物。黃 曲霉毒素Bl主要是污染花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫高濕地 區(qū)受污染最為嚴(yán)重。黃曲霉毒素耐熱，280°C才可裂解，一般烹調(diào)加工溫度下難以破壞，故國(guó) 家質(zhì)檢總局規(guī)定黃曲霉毒素Bl是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一。
[0003] 來(lái)源于雙峰駝的納米抗體在基礎(chǔ)研究、新藥開(kāi)發(fā)以及疾病的診斷和治療以及食品 科學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，已經(jīng)成為一個(gè)重要研究熱點(diǎn)。利用抗體技術(shù)獲得來(lái)源于雙 峰駝特異性針對(duì)黃曲霉毒素B1的納米抗體，從而應(yīng)用于臨床診斷和靶向治療，具有廣闊前 旦 -5^〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種針對(duì)黃曲霉毒素&納米抗體，同時(shí)提供該納米抗體的編碼 序列及該納米抗體用于檢測(cè)黃曲霉毒素B1分子的用途。
[0005] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明第一方面，提供了一種針對(duì)黃曲霉毒素B1納米抗體的VHH鏈，包括框架區(qū) FR和互補(bǔ)決定區(qū)CDR，所述框架區(qū)FR包括下組的FRl?FR4的氨基酸序列：SEQIDN0:1所 示的FRl，SEQIDNO: 2 所示的FR2,SEQIDNO: 3 所示的FR3,SEQIDNO:4 所示的FR4 ;所 述互補(bǔ)決定區(qū)⑶R包括下組的⑶Rl?⑶R3的氨基酸序列：SEQIDNO: 5所示的⑶Rl，SEQ IDN0:6 所示的CDR2,SEQIDNO:7 所示的CDR3。
[0007] 優(yōu)選地，所述的針對(duì)黃曲霉毒素B1納米抗體的VHH鏈，其氨基酸序列如SEQIDNO: 8所示。
[0008] 本發(fā)明第二方面，提供了一種針對(duì)黃曲霉毒素B1納米抗體，其包括一條如SEQID NO:8所示氨基酸序列的VHH鏈。
[0009] 本發(fā)明第三方面，提供了一種DNA分子，其編碼選自下組的蛋白質(zhì)：本發(fā)明所述的 針對(duì)黃曲霉毒素B1納米抗體的VHH鏈，或本發(fā)明所述的針對(duì)黃曲霉毒素Bi納米抗體。
[0010] 優(yōu)選地，所述的DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。
[0011] 本發(fā)明第四方面，提供了一種表達(dá)載體，其含SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
[0012] 本發(fā)明第五方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其可以表達(dá)本發(fā)明所述的針對(duì)黃曲霉毒 素B1納米抗體。
[0013] 本發(fā)明第六方面，提供了本發(fā)明所述的針對(duì)黃曲霉毒素&納米抗體用于檢測(cè)黃曲 霉毒素B1分子的用途。
[0014] 本發(fā)明的有益效果：
[0015] 本發(fā)明使用黃曲霉毒素B1免疫雙峰駝，隨后利用該駱駝外周血淋巴細(xì)胞建立了針 對(duì)黃曲霉毒素B1的噬菌體展示納米抗體文庫(kù)。隨后試驗(yàn)中將黃曲霉毒素Bi偶聯(lián)在酶標(biāo)板 上，利用噬菌體展示技術(shù)篩選免疫性的納米抗體文庫(kù)，從而獲得了針對(duì)黃曲霉毒素B1的特 異性納米抗體基因，將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達(dá)的納 米抗體株。
[0016] 本發(fā)明獲得的納米抗體具有相對(duì)分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、產(chǎn)量高、能特異識(shí)別黃曲 霉毒素B1,較常規(guī)抗體用途更廣。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是經(jīng)鎳柱純化后得到的黃曲霉毒素B1納米抗體的SDS-PAGE的電泳圖，左道 為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子，右道為經(jīng)過(guò)鎳柱純化后的黃曲霉毒素B1納米抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 本發(fā)明首先將黃曲霉毒素&免疫一只雙峰駝，經(jīng)過(guò)7次免疫之后提取該雙峰駝外 周血淋巴細(xì)胞并構(gòu)建了黃曲霉毒素B1特異的單域重鏈抗體文庫(kù)。將黃曲霉毒素B1抗原偶 聯(lián)在酶標(biāo)板上，黃曲霉毒素&表面的抗原表位得以暴露出來(lái)，利用噬菌體展示技術(shù)從文庫(kù) 中篩選黃曲霉毒素&免疫性的納米抗體基因，而獲得了能在大腸桿菌中高效表達(dá)的納米抗 體株，并對(duì)黃曲霉毒素B1具有高度特異性。
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0020] 實(shí)施例1 :針對(duì)黃曲霉毒素&的納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建
[0021] (1)用黃曲霉毒素B1免疫雙峰駝，每次將黃曲霉毒素B1與弗氏佐劑按1 :1體積混 合，每周一次，共免疫7次，第一次使用完全的弗氏佐劑，剩余六次全部使用弗式不完全佐 齊U，在免疫過(guò)程中刺激B細(xì)胞表達(dá)特異針對(duì)黃曲霉毒素B1的納米抗體。（2) 7次免疫結(jié)束 后，提取駱駝外周血淋巴細(xì)胞IOOml并提取總RNA。（3)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并利 用巢式PCR擴(kuò)增VHH鏈，該片段的大小約為500bp。（4)使用限制性的內(nèi)切酶PstI及Not I(購(gòu)自NEB)酶切20ygpComb3噬菌體展示載體（購(gòu)自Biovector)及10ygVHH并連接 兩個(gè)片段。（5)將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞TGl(購(gòu)自北京神州紅葉科技有限公 司）中，構(gòu)建黃曲霉毒素B1的納米抗體文庫(kù)并測(cè)定庫(kù)容，庫(kù)容的大小為3X10 8CFU/mL。（6) 文庫(kù)構(gòu)建完成后，為檢測(cè)文庫(kù)的插入率，隨機(jī)的選取24顆克隆做菌落PCR。結(jié)果顯示：文庫(kù) 插入率已達(dá)到100%。
[0022] 利用巢式PCR擴(kuò)增VHH鏈的具體條件如下：
[0023] 第一次PCR體系：
[0024]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種針對(duì)黃曲霉毒素 B i納米抗體的VHH鏈，包括框架區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū)⑶R，其特 征在于，所述框架區(qū)FR包括下組的FRl?FR4的氨基酸序列：SEQ ID N0:1所示的FR1，SEQ ID N0:2所示的FR2, SEQ ID N0:3所示的FR3, SEQ ID N0:4所示的FR4;所述互補(bǔ)決定區(qū) CDR包括下組的CDRl?CDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO :5所示的CDRl，SEQ ID NO :6所示 的 CDR2, SEQ ID NO :7 所示的 CDR3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)黃曲霉毒素 B i納米抗體的VHH鏈，其特征在于，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :8所示。
3. -種針對(duì)黃曲霉毒素 B ^自米抗體，其特征在于，其包括一條如SEQ ID NO :8所示氨 基酸序列的VHH鏈。
4. 一種DNA分子，其特征在于，其編碼選自下組的蛋白質(zhì)：權(quán)利要求1或2所述的針對(duì) 黃曲霉毒素 B1納米抗體的VHH鏈，或權(quán)利要求3所述的針對(duì)黃曲霉毒素 B i納米抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。
6. -種表達(dá)載體，其特征在于，其含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列。
7. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，其可以表達(dá)權(quán)利要求3所述的針對(duì)黃曲霉毒素 B i納米 抗體。
8. 權(quán)利要求3所述的針對(duì)黃曲霉毒素 B i納米抗體用于檢測(cè)黃曲霉毒素 B i分子的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了針對(duì)黃曲霉毒素B1納米抗體，同時(shí)還公開(kāi)了編碼該納米抗體的基因序列以及能夠表達(dá)該納米抗體的宿主細(xì)胞。通過(guò)本發(fā)明所公開(kāi)的黃曲霉毒素B1納米抗體基因序列及宿主細(xì)胞，該納米抗體能夠在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)，應(yīng)用于黃曲霉毒素B1分子檢測(cè)試劑的研發(fā)。
【IPC分類(lèi)】C12N15-13, C07K16-14, C12N15-70, G01N33-53, C12N1-21
【公開(kāi)號(hào)】CN104610451
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510051598
【發(fā)明人】萬(wàn)亞坤, 龔雪
【申請(qǐng)人】東南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年1月30日