一種透明質(zhì)酸四糖和六糖的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸四糖和六糖的分離方法，尤其是一種分離水蛭透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸得到的以葡萄糖醛酸為末端的透明質(zhì)酸四糖和六糖的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，簡(jiǎn)稱HA)，俗稱玻璃尿酸，是一種由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖為重復(fù)雙糖單位，通過β - (I — 4)和β - (I — 3)糖苷鍵交替連接而成的大分子酸性黏性多糖，1934年由Meyer等人從牛玻璃球眼中首次提取獲得，廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域。研宄表明，透明質(zhì)酸能與細(xì)胞表面受體CD44作用，從而對(duì)癌細(xì)胞的耐藥性產(chǎn)生影響。由牛睪丸來源的透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸產(chǎn)生的透明質(zhì)酸寡糖可與透明質(zhì)酸競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面CD44受體，從而降低癌細(xì)胞的耐藥性。此外，研宄還發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸寡糖具有促進(jìn)血管生成、傷口愈合等重要作用。
[0003]水蛭來源的透明質(zhì)酸酶的酶解作用方式不同于牛睪丸來源的透明質(zhì)酸酶，前者水解透明質(zhì)酸β-α —3)糖苷鍵，生成以葡萄糖醛酸為末端的寡糖系列，而后者水解透明質(zhì)酸β-α —4)糖苷鍵，生成以氨基葡萄糖為末端的寡糖系列。目前常用的分離由牛睪丸透明質(zhì)酸酶制備的透明質(zhì)酸寡糖的方法有HPLC、離子交換法、體積排阻法等，而由于HPLC和體積排阻法不能用于大量制備，適用于工業(yè)化制備寡糖的方法只有離子交換法，常用的離子交換劑有DEAE和DOWEX 1X2。但這些方法并不適用于分離水蛭來源的透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸得到的產(chǎn)物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種透明質(zhì)酸四糖和六糖的分離方法，尤其是一種分離由水蛭透明質(zhì)酸酶制備的以葡萄糖醛酸為末端的透明質(zhì)酸四糖和六糖的方法。
[0005]所述方法主要包括以下內(nèi)容:選用Q瓊脂糖凝膠FF (Q Sepharose Fast Flow，QFF)填充的離子交換柱，高徑比為3:1?6.25:1，平衡溶液(A液)選用pH 8?9、50mM以內(nèi)的Tris-HCl緩沖溶液，平衡柱子時(shí)，平衡溶液流速為2?6ml/min ;洗脫溶液(B液)為相應(yīng)pH的IM NaCl溶液，采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125M NaCl ;根據(jù)出峰的順序收集樣品，將洗脫收集到的樣品濃縮后分別采用Superdex Peptidel0/300GL脫鹽，即得透明質(zhì)酸四糖和六糖。
[0006]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法主要包括以下步驟:(I)以2?6ml/min的速度用5個(gè)柱體積的平衡溶液平衡Q FF離子交換柱；(2)用lml/min流速上樣至樣品穿透點(diǎn)為5% ; (3)用平衡溶液清洗離子交換柱5個(gè)柱體積，流速2?6ml/min ； (4)采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125M NaCl，流速為2?6ml/min，收集所得到的產(chǎn)物峰；(5)濃縮產(chǎn)物，再通過Superdex Peptide 10/300GL凝膠柱進(jìn)行脫鹽，即可得到四糖和六糖。
[0007]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Q FF離子交換柱為HiPrep 16/10Q FF離子交換柱。
[0008]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，平衡溶液選用pH 8、1mM Tris-HCl緩沖溶液。
[0009]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法主要包括以下步驟:(I)以5ml/min的速度用5個(gè)柱體積的平衡溶液平衡HiPrep 16/10Q FF離子交換柱；(2)用lml/min流速上樣至樣品穿透點(diǎn)為5% ; (3)用平衡溶液清洗離子交換柱5個(gè)柱體積，流速5ml/min ; (4)采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125M NaCl，流速為5ml/min，收集所得到的產(chǎn)物峰；(5)濃縮產(chǎn)物，再通過Superdex Peptide 10/300GL凝膠柱進(jìn)行脫鹽，即可得到四糖和六糖。
[0010]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述樣品是水蛭透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸的產(chǎn)物。
[0011]透明質(zhì)酸寡糖的聚合度越高，所需的洗脫離子強(qiáng)度越高，而透明質(zhì)酸二糖在低濃度、高PH下不能交換于離子交換劑上，因此本發(fā)明適用于從含透明質(zhì)酸寡糖四糖和六糖的酶解液中分離出四糖和六糖。通過本發(fā)明方法，首次分離出由水蛭透明質(zhì)酸酶制備的透明質(zhì)酸寡糖，分離效率、純度高，具有較好的回收率(四糖回收率為93.85 %，六糖回收率為90.61 %)，檢測(cè)限低，可用于大量制備透明質(zhì)酸寡糖。
【附圖說明】
[0012]圖1制備的透明質(zhì)酸寡糖(保留時(shí)間8.636min為二糖，10.884min為四糖，
13.608min 為六糖)
[0013]圖2Q FF分離后的四糖(保留時(shí)間為10.804)
[0014]圖3Q FF分離后的六糖(保留時(shí)間為13.715min)
【具體實(shí)施方式】
[0015]Q FF離子交換劑來自浙江爭(zhēng)光實(shí)業(yè)股份有限公司，離子交換柱來自錦州市新科水處理設(shè)備廠。透明質(zhì)酸酶是從水蛭中提取的或由基因工程菌重組表達(dá)水蛭透明質(zhì)酸酶基因得到的。
[0016]寡糖混合液、四糖液和六糖液的液相色譜檢測(cè)方法:色譜柱:YMC_Pack PolyamineII (250mmX 4.6mm);流動(dòng)相:10mM磷酸二氫錢:乙腈(90:10);流速0.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nmo
[0017]實(shí)施例1以葡萄糖醛酸為末端的透明質(zhì)酸寡糖的制備
[0018]于含有去離子水98ml的38°C酶反應(yīng)器中，加入Ig透明質(zhì)酸，38°C保溫15min后，加入酶活為80萬(wàn)U/ml的水蛭透明質(zhì)酸酶液2ml，反應(yīng)進(jìn)行32h后，沸水浴加熱1min。8000轉(zhuǎn)離心15min后棄沉淀取上清。如圖1所示，上清液為含有透明質(zhì)酸二糖、四糖和六糖的混合液。保留時(shí)間為8.636的樣品為透明質(zhì)酸二糖，保留時(shí)間為10.884的樣品為透明質(zhì)酸四糖，保留時(shí)間為13.608的樣品為透明質(zhì)酸六糖。
[0019]實(shí)施例2透明質(zhì)酸四糖和六糖的分離及純度檢測(cè)
[0020]配制A液(平衡溶液):pH 8、1mM Tris-HCl緩沖液，B液(洗脫溶液):由A液配制的0.125M的NaCl緩沖溶液，通過以下條件進(jìn)行透明質(zhì)酸四糖和六糖的分離。
[0021](I)以5ml/min的速度用5個(gè)柱體積的A液平衡HiPr印16/10Q FF離子交換柱(高徑3:1)。
[0022](2)用lml/min流速上樣(實(shí)施例1制備的含有透明質(zhì)酸四糖和六糖的混合液)至樣品穿透點(diǎn)為5%。
[0023](3)用A液洗去樣品，洗脫5個(gè)柱體積，流速5ml/min。
[0024](4)用A液和B液進(jìn)行線性洗脫，使洗脫液中NaCl濃度為0.000M-0.125M，洗脫體積為15個(gè)柱體積，流速為5ml/min，依次收集所得到的峰，由于糖酸聚合度越低，交換能力越弱，二糖不能交換與色譜柱上，根據(jù)出峰的離子強(qiáng)度強(qiáng)弱可以判斷，先出峰的為四糖、緊接出峰的為六糖。
[0025](5)濃縮得到的峰，再通過Superdex Peptide 10/300GL凝膠柱或500?1000透析袋進(jìn)行脫鹽后凍干，即可得到四糖和六糖。
[0026](6)將分離純化的四糖和六糖通過HPLC法檢測(cè)，如圖2和圖3可見四糖和六糖得到了很好的分離，六糖中含有微量的四糖。
[0027](7)取凍干后的四糖和六糖，用咔唑硫酸法測(cè)定透明質(zhì)酸寡糖的純度，測(cè)定結(jié)果四糖純度為64.86 %，六糖純度為58.31 %。
[0028]實(shí)施例3透明質(zhì)酸四糖和六糖回收率
[0029]取實(shí)例2中分離出的四糖和六糖各0.1OOOg,混合后溶于500 μ L，按照實(shí)施例2中操作，上樣量為500 μ L，分離得到脫鹽后的透明質(zhì)酸寡糖，凍干后測(cè)定寡糖重量，其中四糖
0.9385g、六糖0.9061go四糖回收率為93.85%，六糖回收率為90.61%。
[0030]實(shí)施例4透明質(zhì)酸分離下限
[0031]取實(shí)施例1中酶解液，取500 μ L，按照實(shí)施例2中操作，上樣量為500 μ L，最后制得四糖132.46mg、六糖89.60mg，分離效果如實(shí)施例2，四糖純度62.89%，六糖純度55.34%。因此，該分離方法可分離還原糖量(以葡萄糖醛酸計(jì))0.027mg?離子交換劑5%穿透點(diǎn)的樣品。
[0032]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種透明質(zhì)酸四糖和六糖的分離方法，其特征在于，選用Q瓊脂糖凝膠FF填充的離子交換柱，高徑比為3:1?6.25:1，平衡溶液為pH 8?9、50mM以內(nèi)的Tris-HCl緩沖溶液，平衡柱子時(shí)，平衡溶液流速為2?6ml/min ;洗脫溶液為相應(yīng)pH的IM NaCl溶液，采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125M NaCl ;將洗脫收集到的樣品濃縮后分別采用Superdex Peptide 10/300GL脫鹽，即得透明質(zhì)酸四糖和六糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步驟:(I)以2?6ml/min的速度用5個(gè)柱體積的平衡溶液平衡Q FF離子交換柱；(2)用lml/min流速上樣至樣品穿透點(diǎn)為5% ； (3)用平衡溶液清洗離子交換柱5個(gè)柱體積，流速2?6ml/min ； (4)采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125MNaCl，流速為2?6ml/min，收集所得到的產(chǎn)物峰；(5)濃縮產(chǎn)物，再通過Superdex Peptide10/300GL凝膠柱進(jìn)行脫鹽，即可得到四糖和六糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述QFF填充的離子交換柱為HiPrepl6/10Q FF離子交換柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，平衡溶液選用pH8、1mM Tris-HCl緩沖溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步驟:⑴以5ml/min的速度用5個(gè)柱體積的平衡溶液平衡HiPr印16/10Q FF離子交換柱；(2)用lml/min流速上樣至樣品穿透點(diǎn)為5%; (3)用平衡溶液清洗離子交換柱5個(gè)柱體積，流速5ml/min ;(4)采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125MNaCl，流速為5ml/min，收集所得到的產(chǎn)物峰；(5)濃縮產(chǎn)物，再通過Superdex Peptide10/300GL凝膠柱進(jìn)行脫鹽，即可得到四糖和六糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，待分離樣品是水蛭透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸的產(chǎn)物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種透明質(zhì)酸四糖和六糖的分離方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用Q Sepharose fast flow為離子交換劑，pH8～9Tris-HCl為平衡液，pH80.125M的NaCl線性梯度洗脫，可將透明質(zhì)酸四糖和六糖進(jìn)行分離，脫鹽后即得透明質(zhì)酸四糖和六糖純品。
【IPC分類】C07H1-06, C07H7-033, C08B37-08
【公開號(hào)】CN104610467
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510042090
【發(fā)明人】王淼, 呂夢(mèng)嫻, 郝文幸
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年1月27日