利用ssr引物鑒定石榴品種的方法與應(yīng)用
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是利用ssr引物鑒定石榴品種的方法與應(yīng) 用。
[0002]
【背景技術(shù)】： 品種鑒定是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、作物育種和種子檢驗(yàn)上的重要方法，也是保護(hù)作物品種、防止假 冒偽劣品種進(jìn)入市場(chǎng)的重要手段。傳統(tǒng)的果樹(shù)品種檢驗(yàn)方法有形態(tài)學(xué)鑒定與同工酶鑒定 等，但是，形態(tài)學(xué)鑒定所需周期長(zhǎng)，耗費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力。石榴品種的純正是石榴生產(chǎn) 的重要環(huán)節(jié)。在石榴生產(chǎn)中，各種品種混雜現(xiàn)象嚴(yán)重，同名異物、同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重，常規(guī)鑒 定耗時(shí)較長(zhǎng)，田間形態(tài)學(xué)鑒定難度較大，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)不 斷成熟，給果樹(shù)從品種基因組水平上的鑒定開(kāi)辟了途徑。
[0003]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 為實(shí)現(xiàn)上述石榴品種鑒定中出現(xiàn)的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于，提出利用ssr引物鑒定 石榴品種的方法與應(yīng)用，該方法利用分子標(biāo)記技術(shù)，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期實(shí)現(xiàn)石榴品鑒定，具有周 期短，成本低，結(jié)果可靠，節(jié)約人力、物力及土地資源，大大提高了品種鑒定的準(zhǔn)確性。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種SSR引物組，該SSR引物組的 序列如下： Pom04 F:TCCTTTTTACCCAATTTTCA R:TGCACATCTTTTGCTGTAAG Pom06 F:TACTAGGTGGAACCGAACTT R:CCTTGACAACCTCATCTCAT PomlO F:CCTCATTGCTGATGAATCTT R:ACTCGAGAAGCTCTGTGAAG Poml3 F:CACACCCTTCATCAAAAGAT R:GGACTAACAACCAGCCATAG Poml4 F:CGCATTTGGTTGTAGAAGAC R:AGGAGCGTCTGTTTTAATCTT Pom21 F:GACTGGAAGAAGCAGAGACT R:GAAAAGGAAGTAGCAGAGCA Pom24 F:GGAGATTTGAATTGGGAAGT R:GTGGACTAACTCAAGCAAGG Pom39 F:TAGTTGAATAGGCCACATCC R:CTATACAGTCCGAGGACCAC Pom46 F:CTTCCTCCTACCGAACTATG R:CCCACTTTGACACTTCTACC Pom55 F:GAGACAATTGGGATCAGAAA R:AGTCGACGAACTGTGAAATC Pom56 F:CTCGCCATACTACTGAAAGG R:ATTGGGTGAGATATGTTTGG 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用SSR引物組鑒定石榴品種的方法，包括如下步 驟： (1)提取各樣品石槽種質(zhì)DNA ; ⑵利用設(shè)計(jì)的11對(duì)石榴SR引物，擴(kuò)增石榴的基因組DNA ; (3) 電泳檢測(cè)每個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶； (4) 記錄每個(gè)樣品每對(duì)引物的DNA擴(kuò)增帶型； (5) 根據(jù)DNA擴(kuò)增帶型區(qū)分鑒定石榴品種； 進(jìn)一步，所述步驟（2)中PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，60°C復(fù)性 45s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。
[0005] 進(jìn)一步，所述步驟（2)中PCR擴(kuò)增體系包括20ng模板DNA，2. 5 mmol/L Mg2+, 0. 2mmol/L dNTPs, IU TaqDNA 聚合酶，每條引物 250 nmol/L，10 X Buffero,體系中余量用 CldH2O 補(bǔ)齊。
[0006] 進(jìn)一步，所述步驟（5)結(jié)果判定時(shí)，如果兩個(gè)品種在兩個(gè)或兩個(gè)以上SSR標(biāo)記位點(diǎn) 具有不同等位，則判定為不同品種。
[0007] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明的引物特異性高，擴(kuò)增效率好，能快速鑒定石榴 的不同品種，具有周期短，成本低，結(jié)果可靠，節(jié)約人力、物力及土地資源特點(diǎn)。
[0008]
【附圖說(shuō)明】： 圖1本發(fā)明方法SSR引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物檢測(cè)圖。引物Pom21和Pom46在石榴種質(zhì) 中的擴(kuò)增圖。
[0009] 圖2利用本發(fā)明方法產(chǎn)生的不同品種聚類(lèi)分析樹(shù)形圖。
[0010] 圖3利用引物PomH檢測(cè)不同品種聚丙烯酰胺電泳結(jié)果圖。
[0011] 圖4利用引物Pom55檢測(cè)不同品種聚丙烯酰胺電泳結(jié)果圖。
[0012]
【具體實(shí)施方式】： 下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明： 實(shí)施實(shí)例 材料與方法 材料 供試材料均采自安徽省水果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛘埠市水果綜合試驗(yàn)站石榴品種園。收集蛘 埠市懷遠(yuǎn)縣栽培的石榴主要品種。其中包括大笨子及其芽變新品種（'73-06'）。對(duì)各品種 編號(hào)標(biāo)記見(jiàn)表1。
[0013] 表1石榴品種名稱(chēng)、編號(hào)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 利用ssr引物鑒定石榴品種的方法與應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟： (1)提取各樣品石槽種質(zhì)DNA ; ⑵利用設(shè)計(jì)的11對(duì)石榴SSR引物，擴(kuò)增石榴的基因組DNA ; (3) 電泳檢測(cè)每個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶； (4) 記錄每個(gè)樣品每對(duì)引物的DNA擴(kuò)增帶型； (5) 根據(jù)DNA擴(kuò)增帶型區(qū)分鑒定石榴品種； 所述的11對(duì)石榴SSR引物序列如下： Pom04 F:TCCTTTTTACCCAATTTTCA R:TGCACATCTTTTGCTGTAAG Pom06 F:TACTAGGTGGAACCGAACTT R:CCTTGACAACCTCATCTCAT PomlO F:CCTCATTGCTGATGAATCTT R:ACTCGAGAAGCTCTGTGAAG Poml3 F:CACACCCTTCATCAAAAGAT R:GGACTAACAACCAGCCATAG Poml4 F:CGCATTTGGTTGTAGAAGAC R:AGGAGCGTCTGTTTTAATCTT Pom21 F:GACTGGAAGAAGCAGAGACT R:GAAAAGGAAGTAGCAGAGCA Pom24 F:GGAGATTTGAATTGGGAAGT R:GTGGACTAACTCAAGCAAGG Pom39 F:TAGTTGAATAGGCCACATCC R:CTATACAGTCCGAGGACCAC Pom46 F:CTTCCTCCTACCGAACTATG R:CCCACTTTGACACTTCTACC Pom55 F:GAGACAATTGGGATCAGAAA R:AGTCGACGAACTGTGAAATC Pom56 F:CTCGCCATACTACTGAAAGG R:ATTGGGTGAGATATGTTTGG 根據(jù)權(quán)利所要求1所述利用ssr引物鑒定石榴品種的方法與應(yīng)用，其特征是，所述步驟 (2)中PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，60°C復(fù)性45s，72°C延伸lmin，35 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求3所述利用ssr引物鑒定石榴品種的方法與應(yīng)用，其特征是，所述步驟 (2)中PCR擴(kuò)增體系包括包括20ng模板DNA，2.5 mmol/L Mg2+，0.2mmol/L dNTPs，lU TaqDNA 聚合酶，每條引物250 nmol/L，10 X Buffero,體系中余量用ddH20補(bǔ)齊。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述利用ssr引物鑒定石榴品種的方法與應(yīng)用，其特征是所述步驟 (5)結(jié)果判定時(shí)，如果兩個(gè)品種在兩個(gè)或兩個(gè)以上SSR標(biāo)記位點(diǎn)具有不同等位，則判定為不 同品種。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種SSR引物組及其利用該引物鑒定石榴品種的方法；該SSR引物組由20條引物組成；鑒定步驟包括（1）石榴葉片DNA提??；（2）PCR擴(kuò)增；（3）電泳檢測(cè)；（4）數(shù)據(jù)記錄；（5）結(jié)果判定。本發(fā)明引物特異性高，擴(kuò)增效率好，能快速鑒定石榴的不同品種，具有周期短，成本低，結(jié)果可靠，節(jié)約人力、物力及土地資源特點(diǎn)。本發(fā)明可以用于對(duì)供試石榴品種與已知石榴品種進(jìn)行品種鑒定，或構(gòu)建石榴品種數(shù)據(jù)庫(kù)。該方法為準(zhǔn)確鑒定石榴種質(zhì)資源，尤其是同物異名和同名異物現(xiàn)象奠定了基礎(chǔ)，也為新品種保護(hù)奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104611414
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410612733
【發(fā)明人】潘海發(fā), 徐義流, 高正輝, 張金云, 束冰
【申請(qǐng)人】安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所
【公開(kāi)日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2014年11月5日