綠盲蝽特異性coi引物、含有其的試劑盒及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及綠盲蝽特異性COI引物、含有其的試 劑盒及應用。
【背景技術】
[0002] 綠盲蝽Apolygus Iucorum(Meyer-Dilr)屬于同翅目盲蝽科，體綠，善躲藏，反應敏 捷，其若蟲和成蟲以刺吸式口器刺吸植物嫩芽、嫩葉、花蕾、幼果。綠盲蝽幾乎遍布全國各棉 區(qū)，危害棉花，影響棉花產(chǎn)量。尤其在近些年，隨著轉Bt基因棉花的大面積種植，其種群數(shù) 量急劇上升，為害加重，由棉田次要害蟲上升為主要害蟲，甚至還影響了棗樹、葡萄、梨、茶 樹等多種作物。當前，綠盲蝽已成為我國多種作物上的重要害蟲，嚴重影響作物產(chǎn)量。因此， 綠盲蝽防治工作應該受到足夠的重視。
[0003] 在田間，綠盲蝽可被捕食性天敵捕食，比如：捕食性蝽類和蜘蛛等，但對這些天敵 的捕食控制作用研宄還很不充分。了解捕食性天敵對綠盲蝽的控制作用，充分利用和發(fā)揮 這些天敵的潛力，對于更好地進行生物防治意義重大。又由于常規(guī)的腸道解剖、行為觀察、 血清學分析法或同位素標記等傳統(tǒng)研宄方法，不僅需要花費大量的時間，且費用昂貴，特異 性不強，在使用中受到一定的制約。為了準確評估綠盲蝽捕食性天敵對綠盲蝽的控制作用， 需要建立一套快速而準確的分子檢測方法，但目前尚未有針對綠盲蝽的標準檢測方法。聚 合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR)技術具有靈敏度高、特異性強、高效快速 等特點，再加上特異性引物可擴增得到物種特異性的條帶，用此檢測方法可將物種區(qū)分到 種，在物種鑒定中發(fā)揮著極其重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供綠盲蝽特異性COI引物、含有其的試劑盒及應用。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明根據(jù)綠盲蝽的線粒體DNA序列，設計篩選得到一對 綠盲蝽特異性COI引物，其包括：
[0006] 正向引物 AluFl :5' -TTTGGAAATTGACTAGTACCA-3'
[0007] 反向引物 AluRl :5' -GGAAGTGATAATAATAACAGTAGG-3'。
[0008] 本發(fā)明還提供含有引物AluFl和AluRl的用于檢測綠盲蝽的試劑盒。所述試劑盒 還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液等中的至少一種。優(yōu)選地，所述試劑盒 還包括標準陽性模板。
[0009] 本發(fā)明還提供所述引物AluFl和AluRl，以及含有引物AluFl和AluRl的試劑盒在 檢測綠盲蝽中的應用。
[0010] 本發(fā)明還提供一種綠盲蝽的特異性快速PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0011] 1)提取樣品DNA ;
[0012] 2)以步驟1)提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物AluFl和AluRl進行 PCR擴增反應；
[0013] 3)分析PCR產(chǎn)物。
[0014] PCR反應體系以20 μ L計為：
[0015] 模板 DNA Ι.Ομ? 2.5niM dNTPs 0.4μ? 1 ΟμΜ 弓丨物 AIuF 1 0.4μ? 1(^刺引物八丨11111 0.4μ? 51Ι,/μ? Easy DNA 聚合酶 0.2pL 10 x Easy 緩沖液 2·0μΙ.., CkiH2O 補足至 20μΙ^。
[0016] PCR反應條件為：94°C預變性4分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸30 秒，共40個循環(huán)。
[0017] 對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)大小為323bp的DNA擴增條帶 (SEQ ID No. 3)，則判定樣品為綠盲蝽。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 本發(fā)明根據(jù)GenBank中公布的綠盲疇線粒體COI基因序列（Accession No. HQ902161. 1)，設計一對特異性COI引物，該引物具有物種特異性，僅對綠盲蝽具有擴增 效果，擴增產(chǎn)物大小為323bp，靈敏度DNA濃度檢出限為0. 15625ng/ μ L，而對其它物種包括 其近源種、盲蝽屬的其它盲蝽以及其他昆蟲無擴增能力。
[0020] 本發(fā)明在綠盲蝽檢測方面具有很高的價值，尤其當需要檢測大量的樣品量時，本 發(fā)明不僅節(jié)省時間而且準確性高，在實際應用中具有重要的意義。本發(fā)明利用PCR檢測技 術，由特異性引物擴增得到特異性單一條帶，操作簡單，具有高效、價廉、特異性強的特點， 提高了檢測的準確性。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實施例1中綠盲蝽特異性引物AluFl和AluRl在各昆蟲物種中的檢 測結果；其中"Μ"代表DNA Marker，"一"代表陰性對照。
[0022] 圖2為本發(fā)明實施例2中綠盲蝽特異性引物AluFl和AluRl的DNA濃度梯度檢測 結果；其中，M :DNA Marker ;1-12為模板DNA濃度依次2倍稀釋濃度梯度；"一"為陰性對 照。
【具體實施方式】
[0023] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0024] 實施例1綠盲蝽特異性引物AluFl和AluRl對綠盲蝽的擴增效果
[0025] I、綠盲蝽基因組的制備
[0026] 將單頭綠盲蝽放入I. 5mL離心管中將其磨碎進行提取。并將獲得的DNA溶液儲 于-20°C備用，進行PCR擴增時吸取1 μ L溶液作為DNA模板。
[0027] 2、合成檢測綠盲蝽的特異性COI引物
[0028] 綠盲蝽特異性COI引物序列如下：
[0029] 正向引物 AluFl: 5' -TTTGGAAATTGACTAGTACCA-3'
[0030] 反向引物 AluRl: 5' -GGAAGTGATAATAATAACAGTAGG-3，
[0031] 3、PCR 擴增
[0032] 反應體系為 20 μ L，包括：10 X EasyTaq 緩沖液 2. 0 μ L、dNTPs (2. 5mM) 0· 4 μ L、 EasyTaq DNA 聚合酶（5U/yL)0.2yL、正、反向引物（10μΜ)各 0.4yL、模板 DNA l.OyL、 CldH2O 15. 6 μ L。
[0033] PCR反應條件為：94°C 4分鐘；94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，共40個循環(huán)。
[0034] 4、PCR產(chǎn)物鑒定
[0035] 取PCR擴增產(chǎn)物，用1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，于凝膠成像系 統(tǒng)中，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小判定。
[0036] 5、結果
[0037] 利用引物AluFl和AluRl，以綠盲蝽DNA為模板，以其他常見盲蝽和綠盲蝽捕食性 天敵以及其他昆蟲種類（見表1)為對照進行PCR擴增，結果如圖1所示，僅有7、8泳道對 應的綠盲蝽擴增出了 323bp的目的條帶，說明本發(fā)明的引物特異性強?；厥丈鲜?23bp的 目的條帶，進行測序，其序列如SEQ ID No. 3所示。
[0038] 表1引物特異性檢測中所涉及的昆蟲種類
[0039]
【主權項】
1. 綠盲蝽特異性COI引物，其特征在于，其包括： 正向引物AluFl:5' -ITTGGAAAITGACTAGTACCA-3' ； 反向引物AluRl:5' -GGAAGTGATAATAATAACAGTAGG-3'。
2. 用于檢測綠盲蝽的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求1所述的引物。
3. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚 合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的至少一種。
4. 根據(jù)權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
5. 權利要求1所述引物或權利要求2-4任一項所述試劑盒在檢測綠盲蝽中的應用。
6. 綠盲蝽的特異性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取樣品DNA; 2) 以步驟1)提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物AluFl和AluRl進行PCR 擴增反應； 3) 分析PCR產(chǎn)物。
7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反應體系以20yL計為： 模板DNA 1 .O^L 2.5mMdNTPs 0.4^iL 10pM引物AluFl 0 鄭L 10pM引物AluRl 0.4^iL 5U4iLEasyr叫DNA聚合酶 0.2^iL 10xEasy7^緩沖液 2.0|iL ddH20 補足至 20pL。
8. 根據(jù)權利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為：94°C預變性4分鐘； 94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，共40個循環(huán)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體提供了綠盲蝽特異性COI引物、含有其的試劑盒及應用。本發(fā)明根據(jù)綠盲蝽mtDNA的保守序列，設計了一對綠盲蝽特異性COI引物AluF1和AluR1(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)，經(jīng)檢測，該對引物僅對綠盲蝽具有特異性擴增能力，擴增產(chǎn)物大小為323bp，靈敏度DNA濃度檢出限為0.15625ng/μL。本發(fā)明利用PCR檢測技術，由特異性引物擴增得到特異性單一條帶，操作簡單，具有高效、價廉、特異性強的特點，提高了檢測的準確性。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104611444
【申請?zhí)枴緾N201510065000
【發(fā)明人】李金花, 楊帆, 袁海濱, 陸宴輝
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年2月6日