一種油菜種子上黑斑病原菌的pcr檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種油菜種子上黑斑病菌的檢測方法，尤指一種檢測油菜種子上黑斑 病菌的PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在十字花科蔬菜眾多病害中，黑斑病的危害僅次于霜霉病、軟腐病和病毒病3大 病害。在已經(jīng)報道過的鏈格孢屬菌中有近90%以上的種可以引發(fā)多種葉斑病并兼性寄生 于不同種植物。引起十字花科蔬菜黑斑病（black spot disease)的病原菌有3個種，為 蕓薹鏈格孢（Alternaria brassicae)、蕓薹生鏈格孢（A.brassicicola)和蘿卜鏈格孢 (A. japonica)〇
[0003] 十字花科黑斑病在我國是從20世紀(jì)70年代末開始嚴(yán)重發(fā)生的，受害較為嚴(yán)重的 地區(qū)有：河北省、吉林省、北京市、蘭州市、云南省、武漢市、貴州省等地部分地區(qū)。陜西省 十字花科蔬菜黑斑病病原菌以A. brassicicola和A. brassicae為主，引起的病害分別占 34. 82 %和48. 14%。1999年，浙江金華市花椰菜黑斑病發(fā)病的面積達到60 %左右，發(fā)病嚴(yán) 重的時候病株率高達100%。2008年，江西撫州市嚴(yán)重流行油菜黑斑病，嚴(yán)重影響了油菜籽 的產(chǎn)油量和質(zhì)量。
[0004] 油菜黑斑病通過種子傳帶造成異地擴散和蔓延，危害油菜葉片和整株植物，全生 育過程中嚴(yán)重發(fā)病會影響產(chǎn)量和品質(zhì)。油菜黑斑病首要危害葉片、莖和角果。葉片染病會 產(chǎn)生褐色圓形病斑，具同心輪紋，周圍有黃色暈圈，濕度大時著生黑色霉?fàn)钗铩Ｇo上感病形 成橢圓形或梭形輪紋狀病斑，致莖桿或整個植株枯死。發(fā)病植株的葉片、莖、角果等感病部 位會逐漸褪綠和發(fā)生黑色壞死斑，種子感染后引起皺縮和發(fā)芽率降低。
[0005] 病菌孢子萌發(fā)和侵染寄主最適的葉片濕潤期是16?24個小時，最適相對濕度為 90 %左右，最適溫度為25°C。當(dāng)溫度低于20°C或高于25°C時，油菜的感病率減小，病斑小而 少。雖然油菜葉片嚴(yán)重感染黑斑病時會對油菜產(chǎn)量有較大影響，但角果感染對產(chǎn)量及質(zhì)量 的影響比葉片感染更為顯著。角果發(fā)病程度加重時，角果變短，單角果種子粒數(shù)減少，單角 果感病種子粒數(shù)增多，發(fā)芽率、千粒重和含油量下降。
[0006] 研宄表明此油菜黑斑病原菌可經(jīng)種子傳帶，因此種子帶菌檢測就顯得格外重要。 對于油菜種子是否攜帶有病原真菌，以前主要通過對種子所攜帶的微生物進行分離培養(yǎng)， 再根據(jù)培養(yǎng)物所產(chǎn)生孢子的形態(tài)特征進行鑒定。這種方法不僅分離培養(yǎng)時間長，同時也由 于雜菌污染影響分離效果，檢出效率不高。因此，有必要建立一種能準(zhǔn)確鑒定油菜黑斑病的 快速分子檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種油菜種子上 黑斑病原菌的PCR檢測方法，該方法所使用的一對引物是油菜黑斑病菌rDNA-ITS特異的， 本檢測方法所使用的這對引物有別于其它檢測方法。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種用于PCR檢測油菜種 子上黑斑病原菌的特異性引物，該特異性引物為：
[0009] 正向引物：5-CCCACCACTAGGACAAAC-3, SEQ ID No. 1 ;
[0010] 反向引物：5-GACCTTTGCTGATAGAGAG-3, SEQ ID No. 2。
[0011] 上述特異性引物的設(shè)計是基于油菜黑斑病原菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS)序列。
[0012] 本發(fā)明同時提供一種油菜種子上黑斑病原菌的PCR檢測方法，該方法是用上述的 油菜黑斑病原菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最后電泳鑒定。
[0013] 所述PCR擴增時是以單粒經(jīng)表面消毒的油菜種子的DNA為模板，PCR產(chǎn)物大小為 355bp〇
[0014] 對本發(fā)明方法詳細(xì)敘述如下：
[0015] -、引物設(shè)計：
[0016] 本發(fā)明人利用真核生物進化過程中核酸序列的保守性，從NCBI搜索并下載油菜 黑斑病原菌rDNA-ITS的核苷酸序列，運用MEGA4. 0軟件對這些序列進行比對，從擴展名為 mas的文件中找出不同研宄者報告的以上核苷酸序列所共有而其它真菌序列均與之不同的 引物候選區(qū)，設(shè)計出一對引物（由寶生物工程（大連）有限公司合成）：
[0017] 正向引物：5-CCCACCACTAGGACAAAC-3, SEQ ID No. 1 ;
[0018] 反向引物：5-GACCTTTGCTGATAGAGAG-3, SEQ ID No. 2。
[0019] 將正向引物和反向引物分別經(jīng)BLAST檢索，結(jié)合參見圖1及圖2，結(jié)果表明，與正向 引物和反向引物的序列100%覆蓋且100%相同的全部是油菜黑斑病原菌的核苷酸序列。
[0020] 二、DNA的簡易提?。?br>[0021] 采取下述簡易方法提取帶油菜黑斑病原菌的種子DNA :
[0022] (1)取一粒油菜種子進行表面消毒：用75%無水乙醇浸泡30s，再用無菌水清洗兩 次，晾干。
[0023] (2)將晾干后的油菜種子置于I. 5mL離心管中，加100 μ L 0· 5mol/L的NaOH溶液 (最好現(xiàn)配現(xiàn)用），99°C保溫lOmin。
[0024] (3)高溫處理后用槍頭將離心管中的油菜種子充分搗碎，IOOOOrpm離心2min。
[0025] (4)取 5 μ L 上清液加入 100 μ L Tris-HCL(PH = 8, (λ lmol/L)，作為 DNA 模板備 用，-20 °C保存。
[0026] 三、PCR 過程：
[0027] 采用上述引物對帶油菜黑斑病原菌的種子的DNA進行PCR檢測。預(yù)期PCR產(chǎn)物為 355bp〇
[0028] PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，具體見下表1 :
[0029] 表IPCR反應(yīng)體系各主要成分及用量
[0030]
【主權(quán)項】
1. 一種用于PCR檢測油菜種子上黑斑病原菌的特異性引物，其特征在于，該特異性引 物為： 正向引物：5-CCCACCACTAGGACAAAC-3 ; 反向引物：5-GACCTTTGCTGATAGAGAG-3。
2. 如權(quán)利要求1所述的用于PCR檢測油菜種子上黑斑病原菌的特異性引物，其特征在 于，所述特異性引物的設(shè)計是基于油菜黑斑病原菌rDNA-ITS序列。
3. -種油菜種子上黑斑病原菌的PCR檢測方法，其特征在于：該方法是用權(quán)利要求1 或2中任一項所述的油菜黑斑病原菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最后電泳鑒定。
4. 如權(quán)利要求3所述的一種油菜種子上黑斑病原菌的PCR檢測方法，其特征在于：所 述PCR擴增時是以單粒經(jīng)表面消毒的油菜種子的DNA為模板。
5. 如權(quán)利要求4所述的油菜黑斑病原菌的PCR檢測方法，其特征在于：所述PCR產(chǎn)物 大小為355bp。
【專利摘要】一種油菜種子上黑斑病原菌的PCR檢測方法，是用油菜黑斑病原菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最后電泳鑒定；該特異性引物是基于油菜黑斑病原菌核糖體RNA基因的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ribosomal RNA gene internal transcribed spacer，rDNA-ITS)的核苷酸序列，是油菜黑斑病原菌rDNA-ITS特異的，本檢測方法所使用的這對引物有別于其它檢測方法，可以用于快速檢測出油菜種子是否攜帶黑斑病菌，有利于油菜的增產(chǎn)和增質(zhì)。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-04, C12R1-645, C12Q1-68
【公開號】CN104611450
【申請?zhí)枴緾N201510076883
【發(fā)明人】高必達, 商紅紅, 金程凡
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年2月13日