Cp4-epsps特異性納米抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)或生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種針對于CP4-EPSPS蛋白的納 米抗體及其編碼序列以及其在該領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 5_ 稀醇式丙酮莽草酸 _3_ 磷酸合酶（5-enolpyruvyl-shikimate_3-phosp hate synthase，EPSPS:EC 2. 5. 1. 19)是除草劑草甘膦的革E標(biāo)酶，而來自根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium sp.) CP4菌株的EPSPS對高濃度的草甘膦表現(xiàn)出極高的抗性，因此 cp4-印sps基因被廣泛應(yīng)用于多種作物的轉(zhuǎn)基因研宄中，其編碼的CP4-EPSPS是莽草酸途 徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化磷酸稀醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP)與莽草酸-3-磷 酸（shikimate-3_phosphate，SP3)生成5-稀醇式丙酮莽草酸-3-磷酸（EPSP)。向農(nóng)作物 體內(nèi)轉(zhuǎn)入這種基因可使其獲得除草劑草甘膦的抗性，然而，轉(zhuǎn)基因食品的安全問題越來越 受到消費者的關(guān)注，因此，建立一套快速、特異的轉(zhuǎn)基因檢測體系顯得尤為重要。1993年， 比利時科學(xué)家C. Hamers-Casterman等首次在《Nature》上報道：在駱蛇血液中的抗體，有 一半沒有輕鏈，而且，這些缺失輕鏈的"重鏈抗體"（heavy-chain antibodies, HCAbs)能像 正?？贵w一樣與抗原等靶標(biāo)緊密結(jié)合，并且不像單鏈抗體scFv那樣互相沾粘，甚至聚集成 塊。這種抗體只包含一個重鏈可變區(qū)（variable domain of heavy chain of HCAb，VHH) 和兩個常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，更重要的是單獨克隆并表達出來的VHH區(qū)具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn) 定性與抗原結(jié)合活性。VHH是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位，所以VHH也稱納米 抗體（Nanobody，Nb)。納米抗體具有獨特的性質(zhì)如相對分子質(zhì)量小、水溶性好、穩(wěn)定性強、 抗原識別能力強、易于生產(chǎn)等。因此在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面，比其他抗體具有優(yōu)越性。 所以，應(yīng)用納米抗體技術(shù)研發(fā)CP4-EPSPS檢測試劑具有廣闊的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種針對CP4-EPSPS蛋 白的納米抗體，同時提供該納米抗體的編碼序列及該納米抗體在制備檢測試劑中的應(yīng)用。
[0004] 技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] 一種CP4-EPSPS特異性納米抗體，它的VHH鏈包括框架區(qū)和互補決定區(qū)，所述框架 區(qū)FR包括以下氨基酸序列：SEQIDN0:1所示的FR1，SEQIDN0:2所示的FR2，SEQIDNO: 3所示的FR3，SEQIDN0:4所示的FR4;所述互補決定區(qū)CDR包括以下氨基酸序列：SEQID NO:5 所示的CDR1，SEQIDNO:6 所示的CDR2,SEQIDNO:7 所示的CDR3。
[0006] 進一步的，在本發(fā)明中，包括具有SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的VHH鏈。
[0007] 一種DNA分子，它編碼CP4-EPSPS特異性納米抗體的VHH鏈，或CP4-EPSPS特異性 納米抗體。
[0008] 進一步的，在本發(fā)明中，所述DNA分子包括核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。
[0009] 進一步的，在本發(fā)明中，所述的CP4-EPSPS特異性納米抗體在CP4-EPSPS蛋白檢測 方面的應(yīng)用。
[0010] 有益效果：本發(fā)明提供的針對CP4-EPSPS蛋白的納米抗體，首先將CP4-EPSPS蛋白 偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，展示該蛋白的正確空間結(jié)構(gòu)，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選 免疫納米抗體基因庫，從而獲得了 CP4-EPSPS特異性的納米抗體基因，將此基因轉(zhuǎn)至大腸 桿菌中，從而建立能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。通過本發(fā)明所公布的CP4-EPSPS 特異性納米抗體，研發(fā)針對CP4-EPSPS蛋白特異性的檢測試劑，可用于檢測轉(zhuǎn)基因食品，以 解決現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因食品檢測方法成本高、操作復(fù)雜、特異性差的問題。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明CP4-EPSPS特異性納米抗體的DNA的電泳圖；其中泳道M表示蛋白 分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的產(chǎn)物；
[0012] 圖2為本發(fā)明CP4-EPSPS特異性納米抗體的電泳圖；其中泳道M表示蛋白分子量 標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為CP4-EPSPS特異性納米抗體。
【具體實施方式】
[0013] 本發(fā)明將CP4-EPSPS蛋白偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，展示蛋白質(zhì)的正確空間結(jié)構(gòu)，以此形 式的抗原篩選免疫納米抗體基因庫，優(yōu)選駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫，而獲得了能在 大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。
[0014] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0015] 實施例1 :針對于CP4-EPSPS特異性納米抗體文庫的構(gòu)建：
[0016] (1-1)首先將lmg CP4-EPSPS與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只新疆單峰駝，每周 一次，共免疫7次，刺激B細胞表達抗原特異性的納米抗體；
[0017] (1-2) 7次免疫結(jié)束后，提取100mL駱駝外周血淋巴細胞并提取總RNA ;
[0018] (1-3)合成互補脫氧核糖核酸cDNA并利用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴增VHH鏈；
[0019] (1-4)利用限制性內(nèi)切酶Pst I及Not I酶切20ug pComb3噬菌體展示載體及 10 y gVHH鏈，并連接兩個片段；
[0020] (1-5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞TG1中，構(gòu)建CP4-EPSPS納米抗體文庫并測定 庫容，庫容大小為3.6X10 9。
[0021] 如圖1所示，PCR產(chǎn)物電泳條帶大小約為500bp。
[0022] 實施例2 :針對CP4-EPSPS的納米抗體篩選過程：
[0023] (2-1)將溶解在pH 8. 2的lOOmM似110)3溶液中的20 y g CP4-EPSPS蛋白偶聯(lián)在 NUNC酶標(biāo)板上，4 °C放置過夜；
[0024] (2-2)第二天加入lOOyL 0? 1%酪蛋白，室溫封閉2h ;
[0025] (2_3)2h后，加入lOOyL噬菌體，即5X10ntfu免疫駱駝納米抗體噬菌體展示基 因庫，室溫作用lh ;
[0026] (2-4)用0? 05% PBS+Tween-20 (PBST)洗5遍，以洗掉不結(jié)合的噬菌體；
[0027] (2_5)用 lOOmM 三乙醇胺（triethylamine，TEA)將與 CP4-EPSPS 特異性結(jié)合的噬 菌體解離下，并感染處于對數(shù)期生長的大腸桿菌TG1，37°C培養(yǎng)lh，產(chǎn)生并純化噬菌體用于 下一輪的篩選，相同篩選過程重復(fù)3輪，逐步得到富集。
[0028] 實施例3 :用噬菌體的酶聯(lián)免疫方法（ELISA)篩選特異性單個陽性克?。?br>[0029] (3-1)從上述3輪篩選后含有噬菌體的細胞培養(yǎng)皿中，挑選96個單菌落并接種于 含有100 U g/mL的氨芐青霉素的誘導(dǎo)蛋白液體培養(yǎng)基即TB培養(yǎng)基（1L的TB培養(yǎng)基中含有 2. 3g磷酸二氫鉀，12. 52g磷酸氫二鉀，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油）中，生長至對 數(shù)期后，加入終濃度為ImM的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)作為誘導(dǎo)劑，28°C培養(yǎng)過夜；
[0030] (3-2)利用滲透法獲得粗提抗體，并將抗體轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗原包被的酶聯(lián)免疫吸附測 定（ELISA)板中，在室溫下放置lh ;
[0031] (3-3)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入抗鼠抗HA抗體（mouse anti-HA tag antibody，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），在室溫下作用lh ;
[0032] (3-4)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記抗體 (anti-mouse alkaline phosphatase conjugate，艾美捷科技有限公司），在室溫下作用 lh ；
[0033] (3-5)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，于ELISA儀上，在 405nm波長，讀取吸收值；
[0034] (3-6)當(dāng)樣品孔0D值大于對照孔0D值2倍以上時，判為陽性克隆孔；
[0035] (3-7)將陽性克隆孔的菌轉(zhuǎn)搖在含有100 y g/mL的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中以便 提取質(zhì)粒并進行測序。
[0036] 根據(jù)序列比對軟件Vector NTI分析各個克隆株的基因序列，把⑶R1，⑶R2,⑶R3 序列相同的株視為同一克隆株，而其序列不同的株視為不同克隆株，其抗體的VHH鏈的氨 基酸序列如SEQ ID NO :8所示。
[0037] 實施例4 :CP4_EPSPS特異性納米抗體在宿主菌大腸桿菌中表達、純化：
[0038] (3-1)將上述測序分析所獲得不同克隆株的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK6中，并將 其涂布在LA+glucose (即含有氨芐青霉素和葡萄糖）的培養(yǎng)平板上，37°C培養(yǎng)過夜；
[0039] (3-2)挑選單個菌落接種在5mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床培養(yǎng)過 夜；
[0040] (3-3)接種lmL的過夜菌種至330mL TB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到0D值達 到0? 6~1. 0時，加入IPTG，28°C搖床培養(yǎng)過夜；
[0041] (3-4)離心，收菌；
[0042] (3-5)利用滲透法，獲得抗體粗提液；
[0043] (3-6)經(jīng)鎳柱離子親和層析可得到純度較高的CP4-EPSPS特異性納米抗體。如圖 2所示，CP4-EPSPS Nb的分子量為14. 7kDa，等電點pi為8. 40,在大腸桿菌WK6中表達的產(chǎn) 量約為7. 8mg/L。
[0044] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種CP4-EPSPS特異性納米抗體，其特征在于，它的VHH鏈包括框架區(qū)和互補決定 區(qū)，所述框架區(qū)FR包括以下氨基酸序列：SEQ ID N0:1所示的FR1，SEQ ID N0:2所示的FR2， SEQ ID N0:3所示的FR3, SEQ ID N0:4所示的FR4;所述互補決定區(qū)CDR包括以下氨基酸 序列：SEQ ID NO :5 所示的 CDR1，SEQ ID NO :6 所示的 CDR2, SEQ ID NO :7 所示的 CDR3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CP4-EPSPS特異性納米抗體，其特征在于，包括具有SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的VHH鏈。
3. -種DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1或2所述的CP4-EPSPS特異性納米抗 體的VHH鏈，或權(quán)利要求2所述的CP4-EPSPS特異性納米抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO :9所 不〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CP4-EPSPS特異性納米抗體在CP4-EPSPS蛋白檢測方面 的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CP4-EPSPS特異性納米抗體及其應(yīng)用，并公開了其氨基酸序列以及編碼該納米抗體的基因序列。通過本發(fā)明所公布的CP4-EPSPS特異性納米抗體，研發(fā)針對CP4-EPSPS蛋白特異性的檢測試劑，可用于檢測轉(zhuǎn)基因食品，以解決現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因食品檢測方法成本高、操作復(fù)雜、特異性差的問題。
【IPC分類】C12N15-13, C07K16-40, G01N33-573
【公開號】CN104628860
【申請?zhí)枴緾N201510048148
【發(fā)明人】萬亞坤, 錢付平, 李敏
【申請人】東南大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月29日