一種海洋動(dòng)物標(biāo)本保存與dna提取一體化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及海洋動(dòng)物標(biāo)本保存和DNA提取的方法，特別是海洋動(dòng)物標(biāo)本保存與 DNA提取一體化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋生物遺傳育種、系統(tǒng)發(fā)生與多樣性評(píng)估與保護(hù)都離不開分子生物學(xué)作為先進(jìn) 的手段，而最為基礎(chǔ)的工作就是組織樣品中DNA的獲得。標(biāo)本DNA能否成功提取，跟標(biāo)本的 保存條件有很大關(guān)系。目前常用的海洋動(dòng)物標(biāo)本固定主要是用己醇和福爾馬林來(lái)保存和固 定，但不管用多高濃度的酒精固定，都會(huì)導(dǎo)致后期DNA提取得率較低，無(wú)法完成一些DNA完 整性較高的研究如DNA文庫(kù)構(gòu)建、稀有基因的獲得、微衛(wèi)星開發(fā)等。因此，一般DNA質(zhì)量較 高的試驗(yàn)都是用新鮮樣本現(xiàn)場(chǎng)提取DNA，該就對(duì)于野外調(diào)查和一些不能及時(shí)提取DNA的試 驗(yàn)造成了困難，而開發(fā)一種可W長(zhǎng)期保存，又可W進(jìn)行DNA提取的方法將具有很大的優(yōu)勢(shì) 和應(yīng)用前景。
[0003] 由于海洋動(dòng)物長(zhǎng)期生活在海洋環(huán)境中，形成了有別于陸生動(dòng)物的一些特殊性組織 結(jié)構(gòu)和成分，最典型的表現(xiàn)為含水量大、無(wú)機(jī)鹽離子成分復(fù)雜，含量大、一些種類的多糖含 量高，該導(dǎo)致用常規(guī)的動(dòng)物標(biāo)本固定和DNA提取非常困難，且長(zhǎng)期固定后不易獲得高質(zhì)量 的DNA。陸生動(dòng)物基因組DNA提取方法中常規(guī)的為酪-氯仿法，常用己醇保存動(dòng)物標(biāo)本是最 常用且最有效的一種方法，而海洋生物用酒精固定后，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期保存用常規(guī)的酪-氯仿法 很難提取高質(zhì)量的DNA，該極大的限制了研究領(lǐng)域，特別是基因組文庫(kù)的構(gòu)建，一些稀有基 因的擴(kuò)增、單拷貝基因、線粒體基因等，很難完成此類研究任務(wù)。
[0004] 已有學(xué)者對(duì)如何提高福爾馬林固定魚類標(biāo)本DNA提取質(zhì)量進(jìn)行了研究，提出了一 些改進(jìn)的方法，但是尚未有一整套完整的方案能夠得到學(xué)術(shù)界的普遍認(rèn)同，發(fā)表的一些文 獻(xiàn)也有一些經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期固定后得到擴(kuò)增的事例，但依然對(duì)于高質(zhì)量DNA的獲得是一種挑戰(zhàn)。 通過(guò)對(duì)大量甲醒-己醇固定的貝類標(biāo)本DNA的提取及擴(kuò)增的嘗試，僅有小部分標(biāo)本能夠提 取出DNA，而該小部分的標(biāo)本DNA中，又只有少數(shù)能夠進(jìn)行口S的擴(kuò)增。原因可能是由于標(biāo) 本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、密封不夠完好所致。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn) 便的方法，可W采用一體化試劑來(lái)完成海洋動(dòng)物標(biāo)本固定與DNA提取的過(guò)程，獲得高質(zhì)量 DNA，從而提高海洋動(dòng)物分子生物學(xué)的研究效率。
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)W下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種海洋 動(dòng)物標(biāo)本保存與DNA提取一體化方法，其特點(diǎn)是，其步驟如下；
[0007] (1)樣本固定：
[000引 a.將海洋動(dòng)物處死后的全體或者部分放入標(biāo)本瓶，或者同時(shí)按每份動(dòng)物組織 0. 05-lg分裝到2血EP管中；
[0009] b.向標(biāo)本瓶與/或2血EP管中加入標(biāo)本固定與DM提取一體化試劑，完全讓試劑 浸沒動(dòng)物組織，動(dòng)物組織與試劑的質(zhì)量體積比為Ig ;1. 2血；所述的試劑配方為：
[0010] pH = 8. 0 的 lOmmol/L Tris. C1，抑=8. 0 的0.1 mmol/L EDTA，0. 5% SDS，Protease K 0.33g/L ;
[0011] (2)樣本保存；樣本保存條件溫度為-80°C -35°C ;
[0012] (3) DM提?。粚?biāo)本瓶中的組織樣本取0. 05-lg移入2血EP管，并吸取原標(biāo)本瓶 中的固定液0. 6111以或者直接取分裝并加入試劑的2mL EP管，在55°C下消化1-化，W消解液 透明為準(zhǔn)，然后按照常規(guī)的酪一氯仿法提取DNA;當(dāng)固定的是小型海洋動(dòng)物，樣本組織溶解 而無(wú)法取得固定組織時(shí)，直接將原標(biāo)本瓶固定液旋禍后取固定液0. 6mL直接在55°C下消化 1-化，W消解液透明為準(zhǔn)，然后按照常規(guī)的酪一氯仿法提取DNA。
[0013] 本發(fā)明所述的一種海洋動(dòng)物標(biāo)本保存與DNA提取一體化方法的步驟（1)中；所述 的海洋動(dòng)物優(yōu)選自魚類、郵類、蟹類、貝類、腔腸動(dòng)物，也可W為其它的海洋動(dòng)物。在步驟（2) 中；樣本保存條件溫度優(yōu)選為-2〇°C至35°C。在-20°C至35°C可保存至少7個(gè)月W上，不影 響DNA的提取效率。
[0014] W下對(duì)發(fā)明人所作的研究試驗(yàn)進(jìn)行闡述。
[001引一、試驗(yàn)過(guò)程
[0016] (1)取連云港海產(chǎn)海洋生物中，學(xué)界認(rèn)為因多糖含量高、容易降解、最難提取DNA 的貝類中的青始為代表，100個(gè)體分成5組，20°C、35°C、4°C和-20°c該4個(gè)保存溫度為試驗(yàn) 組，W只在W 75%酒精固定后的20°C保存樣本為對(duì)照組。樣本大小為2齡始隨機(jī)樣本。
[0017] 似配制標(biāo)本固定與DNA提取一體化試劑1L，青始配方為；lOmmol/L Tris. C1 (pH =8. 0)，0.1 mmol/L 邸TA(pH = 8. 0)，0. 5% SDS，Protease K 0. 33g/L。
[0018] (3)活體處死去殼后用超純水清洗肌肉，吸水紙吸干后取肌肉約Ig，加入1. 2ml組 織固定與DNA提取一體化試劑。每組固定30支，長(zhǎng)期放在各自恒溫箱內(nèi)，其中4°C和-20°C 在冰箱冷藏和冷凍溫度，20°C和35°C為恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)完成。
[0019] (4)每個(gè)月每組取3-8支進(jìn)行DNA的提取，W評(píng)價(jià)貝類肌肉組織固定和保存后DNA 的提取效果。試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為2012年7月1日-2013年1月30日，每月30日取樣，提取 DNA。
[0020] 巧)DNA提??；將加過(guò)固定液的組織樣本取0. 05g，移入2ml EP管，并吸取原標(biāo)本 瓶中的固定液0. 6ml，在55°C水浴搖床下消化1-化（消化時(shí)間W固定液變透明為準(zhǔn)），然 后按照常規(guī)的酪一氯仿法提取DNA。部分固定的樣本組織溶解，特別是在35°C下保存的樣 本，無(wú)法取得固定組織，直接將原標(biāo)本瓶固定液旋禍后取固定液0. 6ml直接在55°C下消化 1-化（消化時(shí)間W固定液變透明為準(zhǔn)），然后按照常規(guī)的酪一氯仿法提取DNA，具體為裂解 完畢后每只離屯、管加入600 y 1 Tris飽和酪，輕輕振蕩搖勻，顛倒45-55次，室溫靜置10~ 15min，1200化pm，4°C離屯、lOmin，取上清液，加入600 y 1氯仿異戊醇混合液，輕輕振蕩搖 勻，顛倒45-55次，室溫靜置10~15min，12000巧m，離屯、lOmin，取上清液，加入1200 y 1冷 凍無(wú)水己醇，顛倒45-55次，室溫靜置10~15min，8000巧m，離屯、lOmin，棄上清，即得DNA， 在離屯、管中加入1500 y 1 70 %的己醇，洗漆兩次，然后8000巧m，離屯、8min，棄上清，室溫風(fēng) 干，直至己醇揮發(fā)完畢，加入50 y 1TE，溶解DNA，4°C保存，制備0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 [002U 做提取的DM電泳檢測(cè)：圖1為經(jīng)過(guò)固定7個(gè)月的保存后提取DM的電泳檢測(cè) 效果由圖可知，酒精固定后的樣本經(jīng)過(guò)7個(gè)月出現(xiàn)了降解，拖尾現(xiàn)象明顯，DM提取的得率 較低，而其余溫度下每組均獲得了高質(zhì)量的DNA，證明了該種固定和提取一體化方法是成功 的。
[002引 （7)提取的DNA PCR驗(yàn)證檢測(cè)
[0023] 利用GenBank中青始的微衛(wèi)星標(biāo)記QG9-157 (登錄號(hào)JQ768829)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
[0024] 引物序列 F:GTCCTGTCCCAATAAACG ;R:
[00巧]TAGCATTCCTTCGCATAA，反應(yīng)條件；
[0026] 15 y 1 體系；
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種海洋動(dòng)物標(biāo)本保存與DNA提取一體化方法，其特征在于，其步驟如下： (1) 樣本固定： 將海洋動(dòng)物處死后的全體或者部分放入標(biāo)本瓶，或者同時(shí)按每份動(dòng)物組織0. 05-lg分 裝到2mL EP管中； 向標(biāo)本瓶與/或2mL EP管中加入標(biāo)本固定與DNA提取一體化試劑，完全讓試劑浸沒動(dòng) 物組織，動(dòng)物組織與試劑的質(zhì)量體積比為I g :1. 2 mL ;所述的試劑配方為： pH=8. 0 的 lOmmol/L Tris. Cl，pH=8. 0 的 0· lmmol/L EDTA，0. 5% SDS， Protease K 0.33g/L ； (2) 樣本保存：樣本保存條件溫度為-80°C -35°C ; (3) DNA提?。簩?biāo)本瓶中的組織樣本取0. 05-lg移入2mL EP管，并吸取原標(biāo)本瓶中 的固定液〇. 6mL，或者直接取分裝并加入試劑的2mL EP管，在55°C下消化l_4h，以消解液 透明為準(zhǔn)，然后按照常規(guī)的酚一氯仿法提取DNA ;當(dāng)固定的是小型海洋動(dòng)物，樣本組織溶解 而無(wú)法取得固定組織時(shí)，直接將原標(biāo)本瓶固定液旋渦后取固定液0. 6mL直接在55°C下消化 l_4h，以消解液透明為準(zhǔn)，然后按照常規(guī)的酚一氯仿法提取DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海洋動(dòng)物標(biāo)本保存與DNA提取一體化方法，其特征在于， 步驟（1)中：所述的海洋動(dòng)物選自魚類、蝦類、蟹類、貝類、腔腸動(dòng)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海洋動(dòng)物標(biāo)本保存與DNA提取一體化方法，其特征在于， 步驟（2)中：樣本保存條件溫度為-20°C至35°C。
【專利摘要】本發(fā)明是一種海洋動(dòng)物標(biāo)本保存與DNA提取一體化方法，其步驟如下：將海洋動(dòng)物處死后的全體或者部分放入標(biāo)本瓶，或者同時(shí)按每份動(dòng)物組織0.05-1g分裝到2mL EP管中；向標(biāo)本瓶與/或2mL EP管中加入標(biāo)本固定與DNA提取一體化試劑；將標(biāo)本瓶中的組織樣本取0.05-1g移入2mL EP管，并吸取原標(biāo)本瓶中的固定液0.6mL，或者直接取分裝并加入試劑的2mL EP管，在55℃下消化1-4h，然后按照常規(guī)的酚－氯仿法提取DNA。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，操作方便，可以實(shí)現(xiàn)海洋動(dòng)物標(biāo)本保存與DNA提取一體化操作。
【IPC分類】A01N1-00, C12N15-10
【公開號(hào)】CN104630207
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510072067
【發(fā)明人】李曉英, 陳百堯, 張慶起, 趙帥, 伏光輝, 安健, 董志國(guó), 閻斌倫
【申請(qǐng)人】淮海工學(xué)院, 連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司, 連云港市海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究所, 連云港帥森海水養(yǎng)殖專業(yè)合作社
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月11日