Gli2基因作為豬初生重性狀相關(guān)分子標記及制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于豬的分子標記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇 的與初生重性狀相關(guān)分子標記，同時還涉及一種作為豬標記輔助選擇的與初生重性狀相關(guān) 分子標記的制備方法，還涉及一種作為豬標記輔助選擇的與初生重性狀相關(guān)分子標記的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬是重要的經(jīng)濟動物，豬肉由于其肉嫩味美長期W來廣受消費者的青睞，是我國 人民動物性蛋白的主要來源之一。近年來，人們對豬肉的消費量與日俱增，如何提高生產(chǎn)性 能、降低生產(chǎn)成本成了豬育種工作者的工作重點之一。
[0003] 分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展為此提供了重要的契機，憑借該一技術(shù)手段，科學家 們發(fā)掘出了一大批與豬的初生重，斷奶重，產(chǎn)仔數(shù)等重要繁殖性狀顯著關(guān)聯(lián)的分子標記。該 為提高豬的生產(chǎn)性能提供了理論依據(jù)，并從實質(zhì)上使之得到了很大的提高。豬的初生重作 為一個重要的繁殖性狀，與豬出生后的生長速度及育成率有著不可分割的密切聯(lián)系。最近 有很多文獻報道了初生重對生長速度的影響，盧偉（盧偉，劉充，于青云，劉巧，孔俊領(lǐng)，王 子榮.不同初生重仔豬0~60日齡生長性能的比較.養(yǎng)豬[J]. 2010. 6)研究發(fā)現(xiàn)提高仔 豬初生重，有利于保證仔豬后期快速生長。李劍豪(李劍豪.長白豬初生重對生長速度及哺 育率的影響.仔豬生產(chǎn)[J]. 2006. 18)研究發(fā)現(xiàn)長白豬60日齡重與35日齡重均與初生重 呈正相關(guān)且初生重與生長速度呈正相關(guān)。Beaulieu等（Beaulieu AD,Aa化US JL, Williams NH, Patience JF. Impact of piglet birth weight, birth order and litter size on subsequent growth performance, carcass quality, muscle composition and eating quality of pork[J].J Anim Sci. 2010)研究發(fā)現(xiàn)，初生重較低的豬生長速度較慢，從而使 其進入市場的時間增加。另有研究表明仔豬的初生重與育成率亦悉悉相關(guān)，初生重在l.OKg W下時仔豬育成率隨著初生重的增加而上升；初生重在1. OKg W上時仔豬育成率沒有明顯 的規(guī)律。初生重小于等于0. 5Kg時仔豬育成率僅為55. 56%(高建國.二花臉豬初生重對生 長速度及育成率的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，1992,24 (1);26)。因此，對豬初生重相關(guān)基因的 克隆和鑒定可為解釋豬和其它哺乳動物胎兒生長發(fā)育的遺傳機制提供重要線索，并為豬的 繁殖性狀遺傳改良提供理論依據(jù)。
[0004] 化12是調(diào)節(jié)化化edgehog)信號通路的主要的轉(zhuǎn)錄激活子。Hedgehog畑1)家族 分泌信號分子在從果禍到人類的多項胚胎結(jié)構(gòu)的發(fā)育圖式中起到重要的作用（reviewed by In曲am and McMahon, 2001)。化信號分子與化tched(Ptc)受體結(jié)合后抑制其功能， 釋放受其抑制的跨膜蛋白Smoothened(Smo)，進而激活細胞內(nèi)一系列信號級聯(lián)反應。一個 動物的體形大小通常反映出細胞數(shù)目的多少，也就是細胞增殖和細胞死亡的平衡（Raff, M. C.1996.Size control:the regulation of cell numbers in animal. Devell73-175)。 之前的研究表明化信號活性的降低能夠引起鼠的形態(tài)矮小。在多種組織中，S化都具有 促有絲分裂的作用，如原體節(jié)中胚層、視網(wǎng)膜和小腦。另一種化蛋白比h控制軟骨的生 長，比h 缺陷小鼠呈現(xiàn)短肢誅儒表型（Quiang,P.T. and McMahon, A.P. 1999. Ve;rtebrate Hedgehog signaling modulated by induction of Hedgehog-binding protein. 化化re397:617-621)。從而影響胎兒發(fā)育，進而影響仔豬的初生重。因此本發(fā)明擬探討化12 基因與豬初生重的關(guān)系，尋求獲得一種與豬初生重性狀相關(guān)的分子標記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種作為豬標記輔助選擇的與初生重性狀相關(guān)分子 標記，DNA標記輔助育種是利用與目標性狀基因緊密連鎖的DNA分子標記對目標性狀進行 間接選擇的一種現(xiàn)代育種，該方法是對基因型進行直接選擇，與通過表現(xiàn)型間接對基因型 進行選擇的傳統(tǒng)育種方法相比較，它不受環(huán)境影響，不受等位基因顯隱關(guān)系干擾，結(jié)果可 靠；此外，它對目標基因的轉(zhuǎn)移可在育種早期進行選擇，從而大大縮短了育種周期，與常規(guī) 育種相比可提高育種效率達2-3倍，具有明顯的優(yōu)越性。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種作為豬標記輔助選擇的與初生重性狀相 關(guān)分子標記的債I備方法，CAPs (cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)CAPs技術(shù)又稱為PCR-RFLP，限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP)技術(shù)。 是用特異設計的PCR引物擴增目標材料時，由于特定位點的堿基突變、插入或缺失數(shù)很少， W至無多態(tài)出現(xiàn)，往往需要對相應PCR擴增片段進行酶切處理，W檢測其多態(tài)性。CAPS標記 在二倍體植物研究中可發(fā)揮巨大的作用，是PCR標記的有力補充。該種方法與RFLP相比，不 同的是W擴增替代了酶切，避免了 RFLP繁瑣的DNA酶切、轉(zhuǎn)移、雜交等步驟。本發(fā)明是Gli2 基因在序列表SEQ ID NO ;1的第446bp處有一個G446-A446的堿基突變，導致化oI-RFLP 多態(tài)性，為提供了一種作為豬標記輔助選擇的與初生重性狀相關(guān)分子標記的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種作為豬標記輔助選擇的與初生重性狀相 關(guān)分子標記的應用，DNA分子標記在動物體內(nèi)廣泛存在，具有個體、種屬及品種各層次的特 異性，呈簡單孟德爾遺傳，不受雜交方式的制約，標記的非等位基因之間無副作用，標記間 無干擾，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復性強，可廣泛應用到現(xiàn)實育種工作中。
[0008] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)措施：
[0009] 申請人從報道豬基因化12克隆得到與豬初生重性狀相關(guān)基因的部分DNA序列，它 的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO ;1和圖2所述。在序列表SEQ ID NO ;1的第446bp處有 一個G446-A446的堿基突變，導致化oI-RFLP多態(tài)性。該個堿基突變位于化12基因第8外 顯子中。
[0010] 一種作為豬標記輔助選擇的與初生重性狀相關(guān)分子標記的制備方法，其步驟是：
[0011] A、用豬序列（ensemble收錄號；ENSSSCG00000015733)為模板設計引物，提取豬基 因組DNA。
[0012] 1)將大白豬(來自湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學精品豬場，為常規(guī)推廣的外來血緣 的瘦肉型豬種)的肌肉組織在液氮中磨碎，加入等體積IX SET溶液（1ml)，蛋白酶K (lOmg/ 血)至終濃度200 y g/mU十二烷基硫酸軸（即SDS，10% )至終濃度0. 5%，搖勻。55°C水浴搖 床中溫育過夜消化。
[0013] 2)將消化后的組織樣加入等體積的Tris飽和酷，緩慢顛倒離也管15min，于低溫 冷凍離也機中4°C、11000巧m離也lOmin，小也吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離也管中，注意標上 相應的記號。
[0014] 3)加等體積的苯酷/氯仿/異戊醇(體積比25 ;24 ;1)，緩慢顛倒離也管lOmin，于 低溫（-9C到+4CTC)離也機中4°C、11000巧m離也lOmin，小也吸取上清，轉(zhuǎn)移至另一個干 凈的離也管中。
[0015] 4)加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24 ;1)緩慢顛倒離也管lOmin，于低溫 (-91：到+40°〇冷凍離也機中41：、11000巧111離也10111111。
[0016] 5)將上清液吸入標記好的的離也管中，加入2. 5倍體積的預冷無水己醇，即可W 看到白色絮狀DNA。
[0017] 6)用槍頭將DNA沉淀挑出，置于裝有對應號碼的EP管中，室溫（20 - 25°C，W下 相同）下讓己醇揮發(fā)干凈，加入適量的超純水(一般300ul左右）溶解DNA。
[001引 7)在DNA濃度測定儀上測定其濃度與純度，并在（1 %，m/V)瓊脂糖凝膠80伏電泳 約化，紫外燈下檢測提取的DNA質(zhì)量。
[0019] B、設計引物，一般原則如下；序列選取應在基因的保守區(qū)段；避免引物自身或與 引物之間形成4個或4個W上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；典型的引物18 到24個核巧長，引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的 可能性。但是長度大于24核巧的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯 誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量；Tm值在55 - 65C (因為6(TC核酸外切酶活性最高)，GC含量在40% - 60% ;引物之間的TM相差避免超過2°C ; 引物的3'端避免使用堿基A，引物的3'端避免出現(xiàn)3個或3個W上連續(xù)相同的堿基；為避 免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子；引物末端(最后5個核巧酸)不能有超過2個的G 和C。
[0020] 該引物的DNA序列如下所示：正向引物5' -ATGTCCTAAGGAACCAAGCT-3'，反向引物 5' -TCCTGCCTTCTTTTGCTC-3'；
[002。 C、通過PCR擴增、PCR產(chǎn)物純化和測序，獲得如序列表SEQ ID NO ;1和圖2所示的 核巧酸序列。
[002引 一、PCR擴增；反應總體積為lOy 1，其中上述制備得到的豬DNA模板0. 5y 1，雙蒸 水 7. 0y l，bufferly l，Mg2+0. 6y l，10mM 正向引物和反向引物各 0. 3y l，dNTP0. 2y IJaq 酶0. ly l(10U/y 1)。PCR反應條件為；94°C預變性5min后，循環(huán)35次94°C變性30s、57°C 退火30s、72°C延伸25s，最后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)（2%，m/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測。 [002引程序；94攝氏度預變性5min [0024]
【主權(quán)項】
1. 一種GLI2基因作為豬初生重性狀相關(guān)分子標記，其特征在于：與豬初生重性狀相關(guān) 的分子標記，其序列為SEQ ID NO :1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的一種GLI2基因作為豬初生重性狀相關(guān)分子標記，其特征在于：分 子標記的引物對，其核苷酸序列如下所示： 正向引物：5 ' - ATGTCCTAAGGAACCAAGCT- 3 '， 反向引物：5 ' - TCCTGCCTTCTTTTGCTC - 3 '。
3. 權(quán)利要求1所述的一種GLI2基因作為豬初生重性狀相關(guān)分子標記在豬初生重性狀 關(guān)聯(lián)分析中的應用。
4. 權(quán)利要求2所述一種GLI2基因作為豬初生重性狀相關(guān)分子標記，其特征在于：分子 標記的引物對在豬豬初生重性狀關(guān)聯(lián)分析中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種GLI2基因作為豬初生重性狀相關(guān)分子標記及制備方法和應用，其步驟：A、用豬序列為模板設計引物，提取豬基因組DNA。1）將豬的肌肉組織在液氮中磨碎；2）將消化后的組織樣加入等體積的Tris飽和酚，冷凍；3）加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，轉(zhuǎn)移另離心管中；4）加入等體積的氯仿/異戊醇，冷凍，離心；5）將上清液吸入標記好的離心管中，加入無水乙醇；6）用槍頭將DNA沉淀挑出，加入純水溶解DNA；7）在DNA濃度測定儀上測定其濃度，紫外燈下檢測提取的DNA質(zhì)量；B、設計引物，獲得所示的核苷酸序列。結(jié)果可靠，它對目標基因的轉(zhuǎn)移可在育種早期進行選擇，大大縮短了育種周期，提高育種效率達2-3倍，具有明顯的優(yōu)越性。
【IPC分類】C12N15-11, C12N15-10, C12Q1-68
【公開號】CN104630210
【申請?zhí)枴緾N201310570912
【發(fā)明人】李小平, 金秋實, 余梅, 趙書紅, 李長春, 李新云
【申請人】華中農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月13日