昆蟲幾丁質(zhì)去乙?；富?及其在害蟲防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因l(CDAl)及在害 蟲防治中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 飛幢是我國重要農(nóng)業(yè)害蟲，其大規(guī)模遷飛對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。目前對其防 治主要依靠化學(xué)防治。長期施用化學(xué)殺蟲劑導(dǎo)致一系列問題，如環(huán)境污染，抗藥性產(chǎn)生和對 非祀標(biāo)生物的危害。因此開發(fā)新型、可替代化學(xué)防治的方法變得尤為緊迫。
[0003] RNA干擾（RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，自 2006年獲得諾貝爾獎(jiǎng)W來，RNAi技術(shù)一直是生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。RNAi不僅是研究基因 功能的有力工具，同時(shí)在害蟲防治方面也具有極大潛力。通過RNA干擾進(jìn)行害蟲防治具有 如下優(yōu)點(diǎn)；1)殺蟲專一性，對非祀標(biāo)生物無殺傷作用；2)RNA在自然界極易降解，無殘留；3) 對環(huán)境無毒無害，相對安全。因此學(xué)者將其稱為第四代殺蟲劑。基于RNA干擾進(jìn)行害蟲防 治的前提是篩選祀標(biāo)序列獲得對昆蟲具有高致死作用的dsRNA。
[0004] 昆蟲表皮可W防止其體內(nèi)水分散失和免受病原體侵染，幾了質(zhì)是昆蟲表皮的重要 組成成分，幾了質(zhì)致密排列對于昆蟲生長發(fā)育必不可少。幾了質(zhì)去己酷基酶基因l(CDAl) 負(fù)責(zé)將幾了質(zhì)N-己酷基葡糖胺的己酷胺基水解，形成脫己酷幾了質(zhì)（或稱聚葡萄糖胺，殼 聚糖），從而改變其物理性質(zhì)，使表皮蛋白等其它組分更容易與幾了質(zhì)結(jié)合，從而形成致密 的表皮結(jié)構(gòu)。沉默該祀標(biāo)基因后昆蟲出現(xiàn)晚皮受阻而致死的現(xiàn)象。由于人和其他高等動(dòng)物 并沒有幾了質(zhì)，因此，本發(fā)明采用RNA干擾技術(shù)，針對幾了質(zhì)代謝系統(tǒng)篩選幾了質(zhì)去己酷基 酶基因1的dsRNA分子祀標(biāo)相對安全，在飛幢防治中具有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種昆蟲幾了質(zhì)去己酷基酶基因1全長序列及其dsRNA， W及它們的合成方法和在害蟲防治中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供一種飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1全長序列，其核巧酸序列為SEQ ID NO ;1。該基因全長序列是基于飛幢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，捜索獲得的片段通過GeneDoc軟 件對其進(jìn)行拼接，設(shè)計(jì)上游引物CAACGTCACAACCAGTGAGTGTC (SEQ ID NO ; 3)和下游引物 GCGGTACACGATGAAAGATGG(SEQ ID N0;4)，通過 PCR 擴(kuò)增獲得。該核巧酸長度為 1753bp，其 核巧酸序列為SEQ ID NO ;1。
[0007] 本發(fā)明提供一種飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1編碼的氨基酸序列，其特征是核巧 酸序列為SEQ ID NO ;2的序列。該氨基酸序列是對SEQ ID NO; 1進(jìn)行生物信息學(xué)分析后預(yù) 測得到。生物信息學(xué)分析表明CDA1基因的編碼535個(gè)氨基酸，分子量為6化D，理論等電點(diǎn) 為 5. 11。
[000引本發(fā)明提供飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1合成的dsRNA及其在害蟲防治中的應(yīng) 用；基于飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1序列，通過primer premiers. 0軟件設(shè)計(jì)含有T7啟 動(dòng)子的上游引物*33130肖3別03別313肖肖肖1'口'6144〔66〔64644664(：669 10側(cè)；5)和下游引物 taatacgactcac化tagggCCATCATGGTGAACTGGTTG(SEQ ID NO ;6)，通過PCR擴(kuò)增獲得一段長度 為586bp的兩端均為T7啟動(dòng)子的DM片段（SEQ ID NO ;7)。試劑盒純化后按照T7化boMAX? Express RNAi System(Promega)試劑盒說明體外轉(zhuǎn)錄合成的dsRNA。通過微量進(jìn)樣器將合 成的dsRNA注射進(jìn)入飛幢體腔內(nèi)。結(jié)果表明；注射dsRNA后飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1 的mRNA表達(dá)顯著降低，飛幢出現(xiàn)晚皮困難并導(dǎo)致死亡。
[0009] 本發(fā)明的有益效果；飛幢五齡若蟲注射dsRNA后，若蟲在第7天出現(xiàn)晚皮現(xiàn)象，但 只有翅芽張開、背部弓起，舊表皮難W脫去直到死亡，死亡率達(dá)到94. 7% W上。本發(fā)明飛幢 幾了質(zhì)去己酷基酶基因1合成的dsRNA對飛幢具有高的致死率，對于害蟲防治具有重要的 現(xiàn)實(shí)意義，可W為害蟲防治提供新的途徑。
【附圖說明】
[0010] 圖1 ;瓊脂糖凝膠檢測幾了質(zhì)去己酷基基因1全長cDNA序列長度（M為化5000DNA Marker,條帶從小到大依次為 100、250、500、750、1000、1500,2000、3000、5000bp，1 為幾了 質(zhì)去己酷基基因1條帶大?。?br>[0011] 圖2 ;dsRNA注射2化后對幾了質(zhì)去己酷基酶基因1的轉(zhuǎn)錄影響（1為注射dsGFP 的對照組，2為注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組）。0 -actin為內(nèi)參基因。其中沖<0. 05, *沖<0. 01。 [001引 圖3 ;dsRNA對5齡飛幢若蟲生長發(fā)育的影響（1為注射dsGFP的對照組，2和3均 為注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組）。實(shí)驗(yàn)組飛幢出現(xiàn)晚皮困難死亡的表型。
【具體實(shí)施方式】
[001引實(shí)施例1 ;飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因IcDNA全長序列獲得及氨基酸序列分析
[0014] 1.飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因IcDNA片段獲得
[0015] 基于飛幢的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，對其化igene進(jìn)行捜索，經(jīng)NCBI Blastx分析后，確定 獲得1個(gè)飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1的片段。
[0016] 2.飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因IcDNA全長序列獲得
[0017] 將上述基因片段通過GeneDoc軟件進(jìn)行拼接，并采用primer premiers. 0 軟件設(shè)計(jì)上游引物CAACGTCACAACCAGTGAGTGTC(SEQ ID N0;3)和下游引物 GCGGTACACGATGAAAGATGG(SEQ ID NO ;4)，由上海英濰捷基生物有限公司合成。
[001引選取生長健康、大小一致、雌雄各半的5齡飛幢若蟲，在體式顯微鏡下將其表皮快 速解剖下來，并冷凍于液氮中。4頭一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，依照TaKaRa Trizol試劑盒提取RNA。 采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。W此做為模板，結(jié)合設(shè)計(jì)上下游 引物，通過PCR擴(kuò)增獲得幾了質(zhì)去己酷基酶基因全長片段（圖1)，通過Gel Extroaction Kit (Omega)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化后的產(chǎn)物克隆到祀ASY-T3Cloning vector (全式 金公司）中，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大菌液培養(yǎng)，采用Plasmid Mini Kitl (Omega)提取質(zhì)粒檢 測后將菌液送往invitrogen公司測序公司進(jìn)行測序。測序得到核巧酸序列為SEQ ID NO: 1的序列。
[0019] 3.飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1氨基酸序列分析
[0020] 通過Ex化Sy在線軟件對已獲幾了質(zhì)去己酷基酶基因1進(jìn)行翻譯，預(yù)測幾了質(zhì)去 己酷基酶基因1的開放閱讀框編碼535個(gè)氨基酸，分子量為6化D，等電點(diǎn)為5. 11。功能域 預(yù)測發(fā)現(xiàn)幾了質(zhì)去己酷基酶基因1具有信號膚，幾了質(zhì)結(jié)合域（CBD)，低密度脂蛋白受體域 (LDLa)和催化活性域（CDA)。飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1氨基酸與赤擬谷盜CDA1氨基 酸序列的同源度達(dá)到90%。
[0021] 實(shí)施例2 ;飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1的dsRNA合成
[0022] 1.飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因IdsRNA引物的設(shè)計(jì)
[0023] 基于飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因序列，采用primer premiers. 0軟件設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì) dsRNA 引物，其序列分別為 taatacgactcactatagggTCTGTAACGGCGAGAAGGAC(SEQ ID NO ;5) 和taatacgactcactatagggCCATCATGGTGAACTGGTTG(SEQ ID N0;6)(斜體部分為T7啟動(dòng)子）。 所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。
[0024] 2、飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1特異性dsRNA合成
[0025] W上述幾了質(zhì)去己酷基酶基因1提取質(zhì)粒為模板，用含有T7啟動(dòng)子序列上下游引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到一段長度為586bp基因片段（SEQ ID N0;7)，采用Gel Extraction Kit(Omega)試劑盒將PCR產(chǎn)物純化后按照T7I?iboMAX? Express RNAi System(Promega)試 劑盒說明體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。使用NaNo化op 2000(Thermo scientific)進(jìn)行定量，使其 終濃度達(dá)到2. 5 y g/ y 1。保存于-80°C超級低溫冰箱備用。
[0026] 實(shí)施例3 ;飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1的dsRNA致死飛幢實(shí)驗(yàn)
[0027] 1、特異性dsRNA注射
[002引選取28頭生長健康、大小一致、雌雄各半的5齡2天若蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用25 y 1 規(guī)格微量注射器將2. 5 y 1 (6. 25 y g)合成的dsRNA輕輕注射進(jìn)入若蟲側(cè)腹部的二、=腹節(jié) 之間。同時(shí)選取28頭若蟲設(shè)立為對照組，注射相同體積和濃度的dsGFP至對照組體內(nèi)。將 注射后飛幢置于30°C恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)（光照：黑暗時(shí)間=1化：10h，溫度30±2°C， 濕度60% )，每天飼喂新鮮小麥幼苗和麥款。
[0029] 2、飛幢幾了質(zhì)去己酷基酶基因1沉默檢測
[0030] 各收集9頭注射dsGFP和dsLmCDA12化后若蟲蟲體進(jìn)行總RNA提取，并反轉(zhuǎn)錄成第 一鏈cDNA，采用Real-time PCR方法分別檢測目的基因（LmCDAl)和管家基因（e-actin) 的相對表達(dá)量，從而對其沉默效率進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，與對照組比較，注射dsRNA后，處理 組幾了質(zhì)去己酷基酶基因表達(dá)顯著降低（圖2)。每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重 復(fù)3頭若蟲。
[0031] 3、注射dsRNA后五齡若蟲表型觀察
[0032] 五齡若蟲注射dsRNA后，對照組蟲體在5齡第7天全部成功晚皮至成蟲，且晚皮后 成蟲發(fā)育狀態(tài)良好。注射ds LmCDAl后，若蟲同樣在第7天出現(xiàn)晚皮現(xiàn)象，但只有翅芽張開、 背部弓起，舊表皮難W從蟲體上脫去直到死亡（圖3)，死亡率達(dá)到94. 7% W上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種飛蝗幾丁質(zhì)去乙?；富?，其特征在于核苷酸序列為SEQ ID NO :1。
2. 如權(quán)利要求1所述的飛蝗幾丁質(zhì)去乙?；富?編碼的氨基酸序列，其特征在于 氨基酸序列為SEQ ID NO :2。
3. 如權(quán)利要求1所述飛蝗幾丁質(zhì)去乙?；富?合成的dsRNA。
4. 如權(quán)利要求3所述dsRNA的合成方法，其特征在于包括如下步驟：按照飛蝗幾丁 質(zhì)去乙?；富?的核苷酸序列，設(shè)計(jì)含有T7啟動(dòng)子（斜體部分）的上游引物taat acgactcactatagggTCTGTAACGGCGAGAAGGAC 和下游引物 taatacgactcactatagggCCATCATG GTGAACTGGTTG，通過PCR擴(kuò)增獲得兩端為T7啟動(dòng)子的模板，經(jīng)試劑盒純化后按照 T7RiboMAX?Express RNAi System(Promega)試劑盒說明體外轉(zhuǎn)錄合成得到。
5. 如權(quán)利要求3所述飛蝗幾丁質(zhì)去乙?；富?合成的dsRNA在飛蝗防治中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種昆蟲幾丁質(zhì)去乙?；富?(CDA1)全長序列及其在農(nóng)業(yè)害蟲防治中的應(yīng)用。具體為通過生物信息學(xué)方法，從飛蝗轉(zhuǎn)錄組中獲取幾丁質(zhì)去乙?；富?片段，進(jìn)一步調(diào)取獲得序列為SEQ ID NO：1基因全長。依據(jù)SEQ ID NO：1，設(shè)計(jì)并合成該基因的dsRNA，將其注射進(jìn)入飛蝗體腔后可以特異性沉默靶標(biāo)基因，從而使飛蝗難以脫去舊表皮導(dǎo)致死亡。多次實(shí)驗(yàn)表明其致死率達(dá)到94.7％以上。由于本發(fā)明的特異性及高效的致死率，對于害蟲防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，可以為害蟲防治提供新的途徑。
【IPC分類】C12N15-10, C12N9-80, A01N57-16, A01P7-04, C12N15-113, C12N15-55
【公開號】CN104630247
【申請?zhí)枴緾N201510080636
【發(fā)明人】張建珍, 于榮榮, 張敏, 李大琪, 馬恩波
【申請人】山西大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月13日