帶Flag標(biāo)簽的LAMP1真核表達(dá)載體及其在溶酶體分離中的應(yīng)用
【專利說明】帶FI ag標(biāo)簽的LAMP1真核表達(dá)載體及其在溶酶體分離中的 應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種帶Flag標(biāo)簽的LAMP1 (溶酶體膜 蛋白1)真核表達(dá)載體及其在溶酶體分離中的應(yīng)用。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 溶酶體（lysosome)是真核細(xì)胞中由單層脂蛋白膜包繞的含一系列酸性水解酶的 小體，是細(xì)胞內(nèi)吞和細(xì)胞自瞻兩條代謝途徑的共同終點(diǎn)。溶酶體既能通過與吞瞻體融合，酸 化水解通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞的生物大分子物質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞水平的信號傳遞，又能通過與 自瞻體融合，降解通過自瞻途徑包裹到自瞻體中的細(xì)胞器和內(nèi)源性生物大分子，為細(xì)胞提 供生物合成的新原料。通過分子生化手段分離溶酶體對于研究細(xì)胞內(nèi)吞和細(xì)胞自瞻兩條代 謝途徑意義重大。傳統(tǒng)應(yīng)用于分離溶酶體的方法主要是密度梯度離也。密度梯度離也法是 指用一定的介質(zhì)在離也管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混息液或勻漿液置于 介質(zhì)的頂部，通過重力或離也力場的作用使細(xì)胞裂解液分層、分離。該方法通過利用細(xì)胞中 不同細(xì)胞器的沉降系數(shù)不同，在一定離也力作用下，細(xì)胞器會分布到密度梯度的不同區(qū)域 中，最后再通過免疫印跡法鑒定出溶酶體所分布的區(qū)域，并將該一區(qū)域都作為溶酶體分離 出來。
[0003] 密度梯度離也法分離溶酶體耗時(shí)長，分離效率低，而且無法得到純度較高的溶酶 體。LAMP1是溶酶體表面特異性定位的膜蛋白，被廣泛的用作溶酶體的標(biāo)識物。LAMP1蛋白 分子的大部分區(qū)域定位于溶酶體的內(nèi)腔中，僅有C端一小部分跨過溶酶體膜，暴露在溶酶 體表面與胞漿接觸。依據(jù)LAMP1的特性，我們W LAMP1蛋白作為溶酶體的標(biāo)識物，用免疫沉 淀的方法分離溶酶體，會簡化了純化步驟，提高了分離得到的溶酶體的純度。而現(xiàn)有的祀向 細(xì)胞內(nèi)源性LAMP1的抗體特異性和效價(jià)都不高，不離于高效的分離溶酶體。用傳統(tǒng)的密度 濃度梯度法分離溶酶體具有耗時(shí)長，樣品需求量大，而且無法得到純度較高的溶酶體。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的首要目的在于提供一種帶Flag標(biāo)簽的LAMP1真核表達(dá)載體。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述帶Flag標(biāo)簽的LAMP1真核表達(dá)載體在溶酶體分 離中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)；一種帶Flag標(biāo)簽的LAMP1真核表達(dá)載體， 其中所含的帶Flag標(biāo)簽的LAMP1的核巧酸序列為幼日SEQ ID NO. 1所示）；
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種帶Flag標(biāo)簽的LAMPl真核表達(dá)載體，其特征在于其中所含的帶Flag標(biāo)簽的 LAMPl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶Flag標(biāo)簽的LAMPl真核表達(dá)載體，其特征在于：所述帶 Flag標(biāo)簽的LAMPl真核表達(dá)載體所用真核表達(dá)載體為pcDNA3. 1 ( + )載體。
3. 權(quán)利要求1或2所述的帶Flag標(biāo)簽的LAMPl真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于 包括如下步驟： 以Hela細(xì)胞的cDNA為模板，用SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3序列所示的特異性引物 擴(kuò)增得到含BamH I酶切位點(diǎn)及Xho I酶切位點(diǎn)的LAMPl-Flag片段；分別對PCR擴(kuò)增的 LAMPl-Flag基因與pcDNA3. 1 ( + )載體使用限制性內(nèi)切酶BamH I和限制性內(nèi)切酶Xho I進(jìn) 行雙酶切，純化酶切產(chǎn)物；將載體和LAMPl-Flag基因片段按照質(zhì)量比為2. 5:1-5:1的比例 在DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒，通過檢測， 獲得重組表達(dá)載體pcDNA3. I ( + )-LAMPl-Flag。
4. 權(quán)利要求1或2所述的帶Flag標(biāo)簽的LAMPl真核表達(dá)載體應(yīng)用于研究溶酶體代謝 機(jī)制的分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
5. 權(quán)利要求1或2所述的帶Flag標(biāo)簽的LAMPl真核表達(dá)載體在溶酶體分離中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種帶Flag標(biāo)簽的LAMP1真核表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明所述帶Flag標(biāo)簽的LAMP1真核表達(dá)載體中帶Flag標(biāo)簽的LAMP1的核苷酸序列如SEQNO.1所示，通過將LAMP1基因與Flag標(biāo)簽蛋白基因構(gòu)成融合基因，利用載體上的啟動子和信號序列來控制融合基因的表達(dá)，然后采用免疫沉淀的方式分離溶酶體，操作簡便，富集效率高，結(jié)果易于檢測，成本低，可應(yīng)用于高效的分離溶酶體。
【IPC分類】C12N15-85, C12N5-07, C12N15-66
【公開號】CN104630264
【申請?zhí)枴緾N201310560532
【發(fā)明人】張磊, 李紅昌, 楊詩涵
【申請人】中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月12日