一種psa啟動子介導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)的質(zhì)粒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種PSA啟動子介導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)的質(zhì)粒。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，主要發(fā)生在西方發(fā)達(dá)國家的老年人當(dāng)中，近年來在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。前列腺特異性抗原(prostate-specificantigen, PSA)是前列腺上皮細(xì)胞分泌的一種特異蛋白，它在血清中含量的變化可以反應(yīng)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后等情況，目前主要作為前列腺癌臨床診斷、治療及判斷預(yù)后主要敏感指標(biāo)。PSA主要存在于前列腺細(xì)胞與組織中，正常情況下血清中含量較低，當(dāng)患有前列腺癌時，由于腫瘤細(xì)胞的大量增殖及破裂，PSA被大量釋放入血，使得血清中PSA含量大幅升高，因此臨床上以PSA濃度的異常升高作為診斷前列腺癌的一個重要依據(jù)。前列腺上皮細(xì)胞特異性的表達(dá)PSA，因此檢測前列腺上皮細(xì)胞內(nèi)PSA的表達(dá)改變水平，可以更方便、準(zhǔn)確和直觀的反應(yīng)前列腺癌疾病的進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后等。
[0003]熒光素酶作為一種常用的信號分子，目前被廣泛地用于標(biāo)記組織及細(xì)胞。與基于熒光素酶的生物發(fā)光技術(shù)在體內(nèi)檢測的靈敏度更高，在動物體內(nèi)能檢測到12數(shù)量級的細(xì)胞，而熒光成像技術(shù)只能檢測到約16數(shù)量級的細(xì)胞。熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞經(jīng)皮下、靜脈或原位接種在動物體內(nèi)成瘤后，借助于活體成像系統(tǒng)，通過檢測熒光素酶的生物發(fā)光強度，可以間接反映出腫瘤生長的大小和腫瘤轉(zhuǎn)移位置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種PSA啟動子介導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)的質(zhì)粒，該質(zhì)粒由pPSA-ZsGreen顯性骨架和突光素酶Firefly Luciferase基因片段連接而成。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入前列腺癌細(xì)胞，為構(gòu)建前列腺癌的PSA熒光報告基因小鼠模型奠定基礎(chǔ)。通過熒光定位前列腺癌小鼠模型中腫瘤的部位，可為前列腺癌的治療和新型藥物的研發(fā)提供一個可靠的動物模型。
【附圖說明】
[0005]圖1是以前列腺癌LNCaP細(xì)胞株基因組DNA為模板，通過PCR擴增PSA啟動子序列；
圖2是pPSA-FL-Luc質(zhì)粒的構(gòu)建，(A)pZsGreenl-l質(zhì)粒的圖譜，(B)pPSA-FL-Luc質(zhì)粒構(gòu)建電泳結(jié)果:a、PSA-FL-Luc 重組質(zhì)粒；b、pPSA-FL-Luc 酶切產(chǎn)物；c、DL5000 Marker ;d、FL-Luc的PCR擴增產(chǎn)物；
圖3是不同濃度雙氫睪酮對pPSA-FL-Luc報告質(zhì)粒熒光活性強度影響；
圖4是經(jīng)G418篩選2周后所得到的高發(fā)光強度的前列腺癌LNCaP細(xì)胞；
圖5是活體熒光顯像系統(tǒng)觀察前列腺癌瘤體移植，(A)前列腺癌腫瘤原位模型(B)去勢處理模型小鼠:a、未去勢處理組；b、去勢處理組。
【具體實施方式】
[0006]為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進(jìn)一步的說明。但這些具體實施方案不是要以任何方式限制所要求保護的發(fā)明范圍。
[0007]實施例1
1.細(xì)胞株及實驗動物人PCa細(xì)胞株LNCaP，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；人胚腎293T細(xì)胞株，由浙江省器官移植重點研究實驗室保藏提供；SCID鼠購自斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。
[0008]2.主要試劑 RPM1-1640培養(yǎng)基，胎牛血清購自Gibco公司；pGL3_BasicVector、pRL-TK Vector及Luciferase雙突光素酶報告基因試劑盒購自Promega公司；pZsGreenl-1 Vector購自clontech公司；BCA蛋白定量試劑盒,RIPA蛋白裂解液購自碧云天公司；pMD 18-T Vector 購自 Takara 公司；lipofectamine 2000 購自 invitrogen 公司；抗生素G418購自Sigma公司；突光素酶底物D-Luciferin購自B1tium公司。
[0009]3.細(xì)胞培養(yǎng)人PCa細(xì)胞株LNCaP較難培養(yǎng)，選用Croning公司的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板，采用RPM1-1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清，加常規(guī)青霉素、鏈霉素雙抗，置于5% C02、37°C恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。
[0010]4.獲取PSA啟動子序列收集前列腺癌細(xì)胞株LNCaP，采用濃鹽法提取基因組DNA,經(jīng)0D260定量后，以基因組DNA為模板，PCR擴增PSA啟動子序列。根據(jù)Genbank提供的人類PSA基因序列(Gene ID:NC_000019.10)設(shè)計引物。上、下游引物序列為:ForwardPrimer:5’ -CACATTGTTTGCTGCACGTTG-3’，Reverse Primer:5’ -AGCTTGGGGCTGGGGAGCC-3’，PCR擴增產(chǎn)物長度為655bps。
[0011]5.構(gòu)建PSA熒光素酶報告基因質(zhì)粒將PCR產(chǎn)物連接至pMD 18_T載體，測序獲得重組子并命名為pMD 18-PSA。SacI和HindIII雙酶切pZsGreenl-Ι載體及pMD18-PSA載體，分別回收pZsGreenl-Ι線性骨架和PSA啟動子片段，T4 DNA連接酶將兩者連接，構(gòu)建攜帶PSA啟動子的真核表達(dá)載體,命名為pPSA-ZsGreen。設(shè)計兩端分別帶BamHl和 NotI 酶切位點引物，從 pGL3_Basic Vector 克隆 FirefIy Luciferase (FL-Luc)基因全長，利用BamHl和NotI雙酶切FL-Luc片段和pPSA-ZsGreen載體，T4 DNA連接酶將pPSA-ZsGreen顯性骨架和FL-Luc片段連接，構(gòu)建由PSA啟動的熒光酶素真核表達(dá)質(zhì)粒，命名為pPSA-FL-Luc，經(jīng)大量擴增后定量備用。
[0012]6.PSA熒光素酶報告基因質(zhì)粒檢測:取人胚腎293T細(xì)胞株，常規(guī)培養(yǎng)計數(shù)后鋪12孔板，使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度達(dá)50%，采用Iipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染pPSA-FL-Luc質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒至293T細(xì)胞，24hr后采用濃度分別為0.1、1.0、10、50及100nmol/L雙氫睪酮(DHT)處理293T細(xì)胞48hr，收集細(xì)胞總蛋白，采用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光表達(dá)情況。
[0013]7.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選前列腺癌細(xì)胞株LNCaP鋪24孔板，采用400、600、800、1000和1200(單位ug/ml)5個G418濃度篩選，以10-14天內(nèi)LNCaP細(xì)胞全部死亡的最低濃度為最佳G418濃度。采用Iipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pPSA-FL-Luc表達(dá)質(zhì)粒至LNCaP細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染24hr后換含有G418的培養(yǎng)液，每隔3天換液，約2周后挑選單細(xì)胞克隆至96孔板中做熒光素酶活性檢測，陽性細(xì)胞繼續(xù)采用含G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的前列腺癌LNCaP/Luc/PSA穩(wěn)定細(xì)胞系。
[0014]8.構(gòu)建前列腺癌動物模型LNCaP/Luc/PSA穩(wěn)定細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)，取2X106對數(shù)生長期細(xì)胞注射SCID鼠背部靠近腋窩處。觀察8周，等待背部長出腫瘤后將腫瘤取出，剪成ImmX ImmX Imm組織塊，冰上放置備用。另準(zhǔn)備SCID小鼠，乙醚麻醉，下腹部切開約0.8cm切口，牽開膀胱和精囊，可見前列腺背側(cè)葉，將背側(cè)葉被膜剪開1_，將LNCaP腫瘤組織塊放入被膜下，7-0可吸收線縫合2~3針將種植組織包埋固定。操作中防止損傷膀胱和輸尿管，以免影響實驗結(jié)果。
[0015]9.觀察激素敏感性前列腺癌動物模型對去勢治療的反應(yīng)腫瘤原位模型建立后，從第6周起，每隔I周腹腔注射熒光素底物，放入活體熒光顯像系統(tǒng)觀察SCID鼠體內(nèi)熒光發(fā)光部位及強度。將熒光顯像已經(jīng)證實前列腺癌SCID鼠行睪丸去勢切除，通過整體熒光成像系統(tǒng)在1、3及5周觀察全身腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的變化，并觀察與未去勢組相比去勢小鼠的改變情況。
[0016]結(jié)果如下:
1.獲取PSA啟動子序列
以前列腺癌LNCaP細(xì)胞株基因組DNA為模板，通過PCR擴增PSA啟動子序列，從圖1中可以看出，PSA的PCR產(chǎn)物大小片段長度介于500bps與750bps之間，初步證實得到目的條帶，大小為655bps。
[0017]2.構(gòu)建PSA熒光素酶報告基因質(zhì)粒
首先我們將PSA的PCR產(chǎn)物連接至TA克隆載體pMD 18-T上，經(jīng)測序驗證了 PSA的啟動子序列的正確性，并將PSA啟動子序列連接至pZsGreenl-Ι載體上(參見圖2A)。接下來我們以 pGL3_Basic Vector 為模板，通過 PCR 擴增 Firefly Luciferase (FL-Luc)基因全長(1653bps)，酶切后將攜帶PSA啟動序列的pZsGreen顯性骨架和FL-Luc片段連接，構(gòu)建由PSA啟動的熒光酶素真核表達(dá)質(zhì)粒，命名為pPSA-FL-Luc (參見圖2B)。
[0018]3.PSA熒光素酶報告基因質(zhì)粒功能鑒定
采用293T細(xì)胞株，鋪12孔板使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度達(dá)50%左右，采用Iipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染pPSA-FL-Luc質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒海腎熒光素酶內(nèi)對照質(zhì)粒至293T細(xì)胞，24hr后采用濃度分別為0.1、1.0,10,50及100nmol/L雙氫睪酮(DHT)處理293T細(xì)胞，48hr后收集細(xì)胞總蛋白，以0.1 nmol/L的DHT熒光強度為對照，雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測不同濃度DHT處理后的熒光強度情況。結(jié)果顯示，隨著DHT濃度的增加，Iuciferase熒光報告基因活性逐步增強，證明構(gòu)建的pPSA-FL-Luc報告基因質(zhì)粒具有正常的功能(參見圖3)。
[0019]4.前列腺癌LNCaP/Luc/PSA穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選
將pPSA-FL-Luc報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入前列腺癌LNCaP細(xì)胞株，G418篩選2周后挑取單細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)移至96板中，添加熒光素底物顯色，可見所挑取的細(xì)胞發(fā)出較強熒光(參見圖4)。選取發(fā)光強度高的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，同時加G418維持壓力，經(jīng)多次傳代后，凍存再復(fù)蘇培養(yǎng)，LNCaP細(xì)胞株仍能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因。
[0020]5.激素敏感性前列腺癌動物模型對去勢治療的反應(yīng)
在腫瘤原位模型小鼠建立后第6周起，于模型小鼠的腹腔每隔I周注射熒光素酶底物，通過活體熒光顯像系統(tǒng)觀察，可看到模型小鼠前列腺部位出現(xiàn)熒光，為移植的腫瘤組織包塊(圖5A)。之后，我們將前列腺癌SCID模型小鼠行睪丸去勢切除，通過整體熒光成像系統(tǒng)，在去勢切除后第1、3及5周觀察模型小鼠全身腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的變化情況發(fā)現(xiàn)，與未去勢模型小鼠相比，去勢切除后第3周起，腫瘤包塊的增長明顯受到抑制(圖5B)。
【主權(quán)項】
1.一種PSA啟動子介導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)的質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒由pPSA-ZsGreen顯性骨架和突光素酶Firefly Luciferase基因片段連接而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞后應(yīng)用于前列腺癌動物模型的建立。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種前列腺特異性抗原(PSA)啟動子介導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)的質(zhì)粒。該質(zhì)粒由PSA啟動子pPSA-ZsGreen顯性骨架和熒光素酶Firefly Luciferase基因片段連接而成。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞，為構(gòu)建前列腺癌的PSA熒光報告基因動物模型奠定基礎(chǔ)。通過熒光定位前列腺癌動物模型中腫瘤的部位，可為前列腺癌的治療和新型藥物的研發(fā)提供一個可靠的動物模型。
【IPC分類】C12N15-85, A01K67-027
【公開號】CN104630268
【申請?zhí)枴緾N201510040568
【發(fā)明人】姜海, 毛祺琦, 林奕偉, 孔德波, 楊凱
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月27日