肺炎支原體23S rRNA 2063位點(diǎn)A:G突變檢測特異性引物和探針的制作方法
【專利說明】肺炎支原體23S rRNA 2063位點(diǎn)A:G突變檢測特異性引物和探針
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明是一種用于檢測肺炎支原體23S rRNA 2063位點(diǎn)A:G突變的特異性引物和探針。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]肺炎支原體是一種常見的呼吸道病原體,通常導(dǎo)致輕微的上呼吸道感染，如喉嚨痛、咽喉炎和氣管炎，其引起的肺炎占非細(xì)菌性肺炎的50%，還可引起肺外并發(fā)癥，累及一個或多個系統(tǒng)、器官，如皮膚、胃腸道、心血管、骨骼肌肉和腎臟，嚴(yán)重時可致中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)病變，甚至死亡。通過飛沫以氣溶膠形式傳播，存留在鼻、喉、氣管和痰液中，密切接觸可能引起肺炎支原體的暴發(fā)。肺炎支原體無細(xì)胞壁，因此，對影響細(xì)胞壁合成的抗生素如青霉素等不敏感，但是，對影響細(xì)菌蛋白合成的抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類等敏感。大環(huán)內(nèi)酯類是治療肺炎支原體感染的首選藥物，可結(jié)合于肺炎支原體核糖體50S亞基的轉(zhuǎn)肽酶中心與肽輸出通道之間的部分，通過機(jī)械阻塞通道而抑制肽鏈的延伸，從而達(dá)到抑制蛋白合成的目的，其結(jié)合位點(diǎn)由23S rRNA結(jié)構(gòu)域V的核苷酸構(gòu)成，其中2063位點(diǎn)是主要的組成部分。近年來，隨著大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的廣泛使用，臨床分離出了耐藥菌株，提示肺炎支原體耐藥現(xiàn)象的存在。國內(nèi)外的研究表明，產(chǎn)生耐藥的肺炎支原體在23S rRNA序列上發(fā)生點(diǎn)突變，其中，最常見的是2063位點(diǎn)A到G的突變。
[0005]目前，臨床上對肺炎支原體耐藥性的檢查，主要是依靠肺炎支原體的分離及藥敏實(shí)驗(yàn)，由于肺炎支原體分離較為困難，所以靈敏度較低，而且耗時耗力，不利于及時指導(dǎo)用藥。本發(fā)明采用的熒光PCR技術(shù)，操作簡便、檢測迅速、檢出率高，通過一次試驗(yàn)即可明確是否有耐藥肺炎支原體的感染，有利于對疾病進(jìn)行及時診斷及合理選擇治療方案，與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測技術(shù)相比，提高了檢出效率、降低了漏檢率?？蓪Χ喾N臨床樣本進(jìn)行高效可靠的篩查，以及對臨床病情和用藥效果進(jìn)行監(jiān)測，指導(dǎo)合理用藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測肺炎支原體23S rRNA 2063位點(diǎn)A:G突變的引物和探針。
[0007]基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。
[0008]用于檢測檢測肺炎支原體23S rRNA 2063位點(diǎn)A:G突變的特異性引物和探針序列包括:上游引物MPF序列為5’ TGT AAC CNT CTC TTG NCT GTC T 3’，下游引物MPR序列為5’ CGA TTN CTC CTA CCT NTT CTC TA 3’ 和探針 2063P 序列為 5’ FAM CGG GGT CNT CNCGTC CC BHQl 3’。
[0009]本發(fā)明的具體原理是利用一對靶核酸序列的特異性引物和探針，采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，通過PCR實(shí)現(xiàn)靶核酸序列片斷的擴(kuò)增。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)(R)和熒光淬滅基團(tuán)(Q)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，在PCR擴(kuò)增過程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在靶核苷酸片斷上的熒光探針酶切降解，使報告基團(tuán)的熒光信號可以被檢測，熒光信號量的變化與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，從而可以通過熒光強(qiáng)弱來判斷待測樣本中靶核苷酸序列的存在。
[0010]
【附圖說明】
[0011]圖1是利用引物對MPF/MPR和探針2063P檢測肺炎支原體23S rRNA 2063位點(diǎn)A:G突變陽性樣本的熒光PCR擴(kuò)增圖。
[0012]
【具體實(shí)施方式】
[0013]1.引物和探針的設(shè)計:通過分別對所有已知的肺炎支原體23S rDNA序列進(jìn)行比較分析，選擇2063位點(diǎn)所在區(qū)段，設(shè)計多對引物和探針，引物長度一般為20堿基左右。最優(yōu)引物探針序列組合如下:
上游引物 MPF: 5’ TGT AAC CNT CTC TTG NCT GTC T 3’
下游引物 MPR: 5’ CGA TTN CTC CTA CCT NTT CTC TA 3’
探針 2063P: 5’ FAM CGG GGT CNT CNC GTC CC BHQl 3’。
[0014]2.反應(yīng)體系的優(yōu)化:利用臨床分離的耐藥肺炎支原體滅活液作為待檢樣品，用磁珠裂解法抽提肺炎支原體核酸，分裝后貯存于一 80°C。
[0015]2.1引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將肺炎支原體引物濃度分別從0.1 μ mol/L至1.6 μ mol/L作倍比連續(xù)稀釋，通過對試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.2ymol/L。
[0016]2.2探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將肺炎支原體突變檢測用探針濃度分別從0.1 μ mol/L至0.5 μ mol/L作倍比連續(xù)稀釋，通過對試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.16 μ mol/L。
[0017]利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的肺炎支原體23S rRNA2063位點(diǎn)A:G突變的實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系為25 μ L。按照熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)液的配置。
[0018]3.儀器檢測通道的選擇
選擇的熒光檢測通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置。
[0019]4.PCR反應(yīng)條件如下
500C 2min進(jìn)行UNG酶反應(yīng)；95°C 3min, I 個循環(huán)；94°C 10s,62°C 40s,40 個循環(huán)，在62°C 40s階段收集熒光。
[0020]5.檢測結(jié)果分析
如果待檢樣本中含有發(fā)生2063位點(diǎn)A:G突變的肺炎支原體，則顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL，如果待檢樣本中沒有2063位點(diǎn)A:G突變的肺炎支原體，則顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無擴(kuò)增信號，提示上述引物對和探針具有良好的特異性和靈敏度。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(I)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL，說明其靈敏度良好。
[0022](2)本發(fā)明提供的引物和探針對不含2063位點(diǎn)A:G突變的肺炎支原體的樣本沒有檢測信號，說明其特異性強(qiáng)。
[0023](3)由于本發(fā)明是針對2063A:G突變位點(diǎn)，進(jìn)行了程序和體系優(yōu)化，避免了假陰性和假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于檢測和鑒定肺炎支原體23S rRNA 2063位點(diǎn)A:G突變的特異性引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物MPF序列為5’ TGT AAC CNT CTC TTG NCT GTC T3’，下游引物 MPR 序列為 5，CGA TTN CTC CTA CCT NTT CTC TA 3’。
2.一種用于檢測和鑒定肺炎支原體23S rRNA 2063位點(diǎn)A:G突變的特異性探針序列，其特征在于所述的探針序列為5’ FAM CGG GGT CNT CNC GTC CC BHQl 3’。
【專利摘要】一種用于肺炎支原體23S rRNA 2063位點(diǎn)A:G突變的特異性引物和探針。引物序列包括上游引物MPF序列為5’TGTAACCNTCTCTTGNCTGTCT3’，下游引物MPR序列為5’CGATTNCTCCTACCTNTTCTCTA3’和探針2063P序列為5’FAMCGGGGTCNTCNCGTCCCBHQ13’。
【IPC分類】C12R1-35, C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104630329
【申請?zhí)枴緾N201310550380
【發(fā)明人】李楊霞, 杜君卿
【申請人】江蘇默樂生物科技有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月8日