肉蓯蓉苷a標準品的半制備液相色譜方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及標準品的制備方法，具體涉及肉蓯蓉苷A標準品的半制備液相色譜方 法。
【背景技術】
[0002] 肉灰蓉屬（CistancheHoffmg.etLink)為列當科（Orobanchaceae)多年生草 本寄生植物，主要分布在溫暖的沙漠、荒漠地帶，我國主要分布于西北各省區(qū)，新疆是其中 主要產(chǎn)區(qū)。該種植物在我國有4種1變種，分別為荒漠肉灰蓉（Cistanchedeserticola Y.C.Ma)、管花肉灰蓉（Cistanchetubulosa(Schenk)Wight)、鹽生肉灰蓉（Cistanche salsa(C.A.Mey.)G.Beck)、沙灰蓉（CistanchesinensisG.Beck)、及白花鹽灰蓉 (C.salsa(C.A.Mey. )G.BeckVar.albioforaP.F.TuetZ.C.Lou)。鹽生肉灰蓉（Cistanche salsa(C.A.Mey. )G.Beck)又名肉灰蓉、鹽生大蕓，其中含有大量的苯乙醇苷類及環(huán)稀醚貓 類、揮發(fā)性成分、木脂素類、多糖、生物堿等。主要藥理作用：增強免疫功能、補腎壯陽、抗氧 化抗衰老、抗輻射、通便等。其中苯乙醇苷類具有壯陽、有抗炎抗菌、抗腫瘤、保肝、抗氧化、 抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、強心增強記憶等多種功能，是肉蓯蓉中的主要活性成分。
[0003] 肉蓯蓉苷A是鹽生肉蓯蓉中含量較高的苯乙醇苷類，根據(jù)現(xiàn)有技術的文獻報道， 可根據(jù)肉蓯蓉苷A的含量多少作為鑒別鹽生肉蓯蓉、管花肉蓯蓉、荒漠肉蓯蓉的依據(jù)。因此 進一步研宄肉蓯蓉苷A單體的活性和體內(nèi)藥物學過程具有重要的意義。肉蓯蓉苷A的對 照品在現(xiàn)今的市面上幾乎沒有，因此，有必要對其迸行分離和純化，以滿足實驗和市場的需 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷，提供了一種肉蓯蓉苷A標準品的 半制備液相色譜方法，利用半制備高效液相色譜結(jié)合大孔吸附樹脂和薄層層析色譜技術從 鹽生肉蓯蓉的乙醇提取物中分離純化得到純度達到95%以上的肉蓯蓉苷A。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為：肉蓯蓉苷A標準品的半制備液相 色譜方法，包括以下步驟：
[0006] 1)將鹽生肉蓯蓉的干燥肉質(zhì)莖5kg粉碎成粗粉后，用70%乙醇加熱回流提取3 次，每次2h，合并提取液，濃縮得浸膏，加少量水混懸，得到混懸液；
[0007] 2)將步驟1)得到的混懸液，依次用乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，直至上層澄清 為止，萃取液濃縮成浸膏，得到肉蓯蓉萃取浸膏；
[0008] 3)取水飽和正丁醇萃取物900g，用水溶解，注入柱體積5. 5L的D-101大孔吸附樹 脂柱中，以6倍柱體積去離子水洗脫，回收洗脫液，濃縮備用；分別以10倍柱體積的10%、 20 %、30 %乙醇-水溶液洗脫，回收洗脫液，濃縮備用；再用40 %的乙醇-水洗脫，以1000mL 為一個餾分，用GF254薄層板檢識，以5%的香草醛-濃硫酸作為顯色劑；
[0009] 4)收集并合并有目標的餾分減壓濃縮成浸膏，濃縮物30g經(jīng)薄層層析硅膠H柱用 最佳流動相：氯仿：正丁醇：甲醇：水為4:2:2:0. 5洗脫，是采用干法上柱，干法上樣，空白 硅膠1. 5kg，伴樣硅膠：樣品=2:1，直至有流動相流出，按照硅膠洗脫后顏色變化情況將柱 子切成10段，每段用甲醇沖洗至濃縮不出浸膏即可，并用GF254薄層板檢識，將含有較高純 度的8段浸膏10g中取lg上ODS柱，其中樣品：ODS為1:10,柱內(nèi)徑為1.8cm，依次用5%、 10 %、20 %至100 %的甲醇-水溶液洗脫10個柱體積，減壓濃縮至干，減壓濃縮的水浴鍋溫 度小于60°C，并用GF254薄層板檢識，將含量較高的5%、10%甲醇-水洗脫部分分別上半 制備液相；
[0010] 5)將0DS5%甲醇-水洗脫部分浸膏用甲醇溶解配置成10mg/mL的濃度，采用半 制備型高效液相色譜法純化，進樣量為100y1，收集保留時間為47. 8min的組分，再將其在 小于60°C下減壓濃縮，得到淡黃色無定形粉末；或?qū)?DS10%甲醇-水洗脫部分浸膏用甲 醇溶解配置成18. 3mg/mL的濃度，采用半制備型高效液相色譜法純化，進樣量為100y1，收 集保留時間為45. 8min的組分，再將在小于60°C下減壓濃縮，得到淡黃色無定形粉末。
[0011] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的肉蓯蓉苷A標準品的半制備液相色譜方法， 得到的淡黃色無定形粉末，經(jīng)過熔點、熔程的測定、薄層色譜法檢測純度、顯色反應、核磁結(jié) 構(gòu)鑒定及高效液相色譜法檢測純度，證明了上述淡黃色無定形粉末是純度大于95%的肉蓯 蓉苷A單體，此方法操作簡便，重現(xiàn)性好，可用于肉蓯蓉苷A及其他苯乙醇苷類化合物的大 量制備。
【附圖說明】
[0012] 圖1為0DS5 %甲醇-水洗脫部分半制備高效液相色譜圖。
[0013] 圖2為0DS10%甲醇-水洗脫部分半制備高效液相色譜圖。
[0014] 圖3為不同點樣量的淡黃色無定形粉末氯仿-乙酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸= 1:8:1:2:3 展開圖。
[0015] 圖4為不同點樣量的淡黃色無定形粉末氯仿-正丁酮-甲醇-無水甲酸=6:1:2:2 展開圖。
[0016] 圖5為不同點樣量的淡黃色無定形粉末氯仿-正丁酮-甲醇-無水乙酸=6:1:2:2 展開圖。
[0017] 圖6為苷A純度檢測高效液相色譜圖（254nm)。
[0018] 圖7為苷A純度檢測高效液相色譜圖（332nm)。
[0019] 圖8為肉蓯蓉苷A的化學結(jié)構(gòu)式。
【具體實施方式】
[0020] 一、儀器及試劑來源：
[0021] 1、所用儀器及來源：
[0022] 高效液相色譜儀（WatersE2695)，檢測器（Waters2998PDA檢測器）；液相工作 站（Empower3,Waters);半制備液相色譜儀（日本島津LC-600)，檢測器（島津SPD-10A)， 半制備液相工作站（浙江大學智達信息工程有限公司N2000);超導核磁波譜共振儀（IN0VA 600M，，美國VARIAN公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1001V型，日本EYELA) ;D-101大孔吸附樹脂 (滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；硅膠H薄層層析硅膠（青島海洋化工有限公司制 造）；硅膠GF254(20Xl〇cm，青島海洋化工分廠，批號20130312);超低有機物超純水機 (Milli_Q，Millipore);依利特HypersilBDSC18(4.6mmX250mm，5iim);半制備色譜柱 COSMOSILPackedColumn5C18-MS-II(201.D.X250mm，5ym);SGWX-4 顯微熔點儀（上 海精密科學儀器有限公司）；半自動點樣儀（CAMAGLINOMAT5);薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng) (CAMAGREPROSTAR3) ;100y1 微量進樣針。
[0023] 2、所用試劑及來源：
[0024] 三氯甲燒、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、甲醇、無水甲酸、無水乙酸、95%乙醇、水（雙 蒸），濃硫酸、無水乙醇（均為分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；香草醛（天津市天 隆精細化工分公司）；色譜乙腈、色譜甲醇（均為色譜純，sigma)。實驗所用鹽生肉蓯蓉藥 材均為新疆吉木薩爾縣和奇臺縣。
[0025] 二、色譜條件：
[0026] 半制備型HPLC:C0SM0SILPackedColumn5C18-MS-II(20I.D.X250mm，5ym);流 動相：乙腈-水（體積比：17:83);流速5mL/min;檢測波長為332 ;進樣體積100y1 ;柱溫 為室溫。
[0027] 高效液相型HPLC:色譜條件：依利特BDS柱（4. 6mmX250mm，5um);流動相：乙腈 (△)-0.45%磷酸-水出），梯度洗脫如表1所示，流速0.75111171^11;柱溫351：;檢測波長 332nm和 254nm;進樣體積 10y1。
[0028] 表 1
[0029]
[0030] 實施例丄：
【主權(quán)項】
1.肉蓯蓉苷A標準品的半制備液相色譜方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將鹽生肉蓯蓉的干燥肉質(zhì)莖5kg粉碎成粗粉后，用70%乙醇加熱回流提取3次，每次 2h，合并提取液，濃縮得浸膏，加少量水混懸，得到混懸液； 2) 將步驟1)得到的混懸液，依次用乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，直至上層澄清為止， 萃取液濃縮成浸膏，得到肉蓯蓉萃取浸膏； 3) 取水飽和正丁醇萃取物900g，用水溶解，注入柱體積5. 5L的D-101大孔吸附樹脂 柱中，以6倍柱體積去離子水洗脫，回收洗脫液，濃縮備用；分別以10倍柱體積的10%、20%、 30%乙醇-水溶液洗脫，回收洗脫液，濃縮備用；再用40%的乙醇-水洗脫，以1000 mL為一 個餾分，用GF254薄層板檢識，以5%的香草醛-濃硫酸作為顯色劑； 4) 收集并合并有目標的餾分減壓濃縮成浸膏，濃縮物30g經(jīng)薄層層析硅膠H柱用最佳 流動相：氯仿：正丁醇：甲醇：水為4:2:2:0. 5洗脫，是采用干法上柱，干法上樣，空白硅膠 I. 5kg，伴樣硅膠：樣品=2:1，直至有流動相流出，按照硅膠洗脫后顏色變化情況將柱子切 成10段，每段用甲醇沖洗至濃縮不出浸膏即可，并用GF254薄層板檢識，將含有較高純度 的8段浸膏IOg中取Ig上ODS柱，其中樣品：ODS為1:10,柱內(nèi)徑為I. 8cm，依次用5%、10%、 20%至100%的甲醇-水溶液洗脫10個柱體積，減壓濃縮至干，減壓濃縮的水浴鍋溫度小于 60°C，并用GF254薄層板檢識，將含量較高的5%、10%甲醇-水洗脫部分分別上半制備液相； 5) 將ODS 5%甲醇-水洗脫部分浸膏用甲醇溶解配置成10mg/mL的濃度，采用半制備 型高效液相色譜法純化，進樣量為100 μ 1，收集保留時間為47. Smin的組分，再將其在小于 60°C下減壓濃縮，得到淡黃色無定形粉末；或 將ODS 10%甲醇-水洗脫部分浸膏用甲醇溶解配置成18. 3mg/mL的濃度，采用半制備 型高效液相色譜法純化，進樣量為100 μ 1，收集保留時間為45. Smin的組分，再將在小于 60°C下減壓濃縮，得到淡黃色無定形粉末。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肉蓯蓉苷A標準品的半制備液相色譜方法，是利用半制備高效液相色譜結(jié)合大孔吸附樹脂和薄層層析色譜技術從鹽生肉蓯蓉的乙醇提取物中分離純化得到純度達到95%以上的肉蓯蓉苷A。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的肉蓯蓉苷A標準品的半制備液相色譜方法，得到的淡黃色無定形粉末，經(jīng)過熔點、熔程的測定、薄層色譜法檢測純度、顯色反應、核磁結(jié)構(gòu)鑒定及高效液相色譜法檢測純度，證明了上述淡黃色無定形粉末是純度大于95%的肉蓯蓉苷A單體，此方法操作簡便，重現(xiàn)性好，可用于肉蓯蓉苷A及其他苯乙醇苷類化合物的大量制備。
【IPC分類】C07H1-08, C07H15-18
【公開號】CN104650161
【申請?zhí)枴緾N201410842745
【發(fā)明人】熱娜·卡斯木, 曹苑, 王曉梅, 楊建華, 胡君萍, 王新玲, 王小青, 李敏
【申請人】新疆醫(yī)科大學
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年12月30日