一種脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙孢蘑燕又稱白蘑燕、蘑燕、洋蘑燕，是世界上栽培最廣泛、 生產(chǎn)量和消費量最大的食用菌，產(chǎn)量約占世界食用菌總產(chǎn)量的3/4。然而，雙孢蘑菇的遺傳 轉(zhuǎn)化一直缺乏簡便有效的方法。雙孢蘑菇遺傳轉(zhuǎn)化方法先后報道的有原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化法、 原生質(zhì)體PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法轟擊雙孢蘑菇的菌絲體和子實體、及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菌 褶轉(zhuǎn)化法，把外源基因轉(zhuǎn)入雙孢蘑菇菌株中。這些方法普遍存在操作繁瑣、裝置復(fù)雜、轉(zhuǎn)化 率低、轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定等缺點。有些方法需要制備原生質(zhì)體，制備過程復(fù)雜，如原生質(zhì)體電轉(zhuǎn) 化法和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。有些方法不需要制備原生質(zhì)體，但裝置復(fù)雜、轉(zhuǎn)化成本 高，如基因槍轉(zhuǎn)化法。有些方法的轉(zhuǎn)化率不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率受多種因素的影響，如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 法轉(zhuǎn)化率受農(nóng)桿菌菌株類型、質(zhì)粒載體類型及兩者間的匹配情況、培養(yǎng)基成分及誘導(dǎo)條件 等多種因素的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶的方 法，該方法操作簡便快捷、轉(zhuǎn)化率高、轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定，不需要復(fù)雜裝置。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶的方法，其包括以下步驟： 1) 采摘菌褶未破的幼嫩雙孢蘑菇子實體，清潔表面后，收集菌褶組織并切成塊，獲得菌 褶組織塊； 2) 將脂質(zhì)體Lipofectamine? 2000 和質(zhì)粒pBHg-dsACO混勻，于-5 - 5°C放置 15 - 60min； 3) 將步驟2)產(chǎn)物用無菌超純水稀釋1000倍，然后與步驟1)菌褶組織塊混勻，室溫 (25±5°C)放置 80 - 120min; 4) 將步驟3)所得產(chǎn)物加入到RCM固體培養(yǎng)基中，20 - 30°C培養(yǎng)8 - 12d; 5) 將萌發(fā)的雙孢蘑菇菌褶組織塊轉(zhuǎn)移到含潮霉素的PDA平板上，20 - 30°C培養(yǎng)10 - 20d； 6) 切下新生長的菌絲塊移植到PDA斜面進(jìn)行培養(yǎng)，如此傳代培養(yǎng)2 - 5次，再轉(zhuǎn)接到含 潮霉素的PDA平板上，能夠正常生長的即為轉(zhuǎn)化子?？蓪⑥D(zhuǎn)化子接種到常規(guī)PDA斜面進(jìn)行 培養(yǎng)和保存。
[0005] 具體的，所述步驟2)中將1ML脂質(zhì)體Lipofectamine? 2000和2 - 3Mg質(zhì)粒 pBHg-dsACO混勻。
[0006]所述步驟4)中的RCM固體培養(yǎng)基組成為：胰蛋白胨2. 0 g，酵母提取物2. 0 g， MgS04 ? 7H20 0? 5g，K2HP04 0? 46g，KH2P04 1g，葡萄糖 20g，瓊脂 20g，甘露醇 109. 3g，蒸 餾水 1000mL，pH7. 0。
[0007] 所述步驟5)和6)中的PDA平板含潮霉素濃度為20 - 100iig/mL。
[0008] 和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的雙孢蘑菇脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化菌褶方法具有操作簡 便、快捷，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定，且不需要制備原生質(zhì)體，不需要復(fù)雜裝置等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0009] 圖1為質(zhì)粒pBHg-dsACO的物理圖譜； 圖2為雙孢蘑菇的轉(zhuǎn)化子；CK:AS2796出發(fā)菌株；箭頭處為在復(fù)篩抗性板上長出的轉(zhuǎn) 化子； 圖3為轉(zhuǎn)化子的PCR驗證；A為hph基因PCR結(jié)果；B為AC0基因PCR結(jié)果；圖中，M:DNAMarker;WT:出發(fā)菌株AS2796;p:質(zhì)粒pBHg-dsACO;1-5,轉(zhuǎn)化子； 圖4為轉(zhuǎn)化子AC0基因的半定量PCR分析；WT:出發(fā)菌株AS2796 ; 1-5 :轉(zhuǎn)化子；**，與WT相比差異達(dá)到顯著水平（p〈0. 01); 圖5為轉(zhuǎn)化子AC0酶活力測定結(jié)果；WT:出發(fā)菌株AS2796 ;1-5 :轉(zhuǎn)化子；WT:*，與WT相 比差異達(dá)到顯著水平（P〈〇.05); 圖6為轉(zhuǎn)化子乙烯合成量測定結(jié)果；WT:出發(fā)菌株AS2796 ;1-5 :轉(zhuǎn)化子；WT:*，與WT相 比差異達(dá)到顯著水平（P〈〇.05)。
【具體實施方式】
[0010] 以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
[0011] 實施例1 1實驗材料 1.1菌株 雙孢蘑菇CGMCCN0. 0214,來自中國普通微生物菌種保藏管理中心。
[0012] 1.2 質(zhì)粒 質(zhì)粒pBHg，購自美國Sylvan公司。質(zhì)粒pBHg-dsACO由pBHg改造而成，含有潮霉素 抗性基因（AM)表達(dá)框和雙孢蘑菇1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶基因M仍）部分 序列雙鏈RNA(dsRNA)的表達(dá)框，其物理圖譜見圖1，其中S-AC0的序列為：GAACCCACCCAG AACCTCTTAGGCCGTTCCTATCTGAAATCGACGATTTCTCGGATCAAATCCACTCTGATATAATTAACACAATTCTT CGCCTCATCGCAATGAGCTTGGAGCTAGATGAAGATTACTTCATCCAAATGCATGATCGTTCTGCGAACGCAGAAAC ATTCCTCCGGTTTGTGAATTATTTCCCTCATCCAGAAGAAGAAGAGAATAAATCCGGCGGAGTCTGGTTGAAAGGAC ATACTG，R-AC0 的序列為：ACCTAGCAGCCGAACATCATCGGGGGACAGTCCTTAAGTTAACGGAGAGGTTATA ACTGTTCTTGAGGTAAGAGTTGCACGAACTGGGTGAAGGTAACGGGTAGAAATCAGTAATAGACCTCCCTACGATGA CCGACCGACTTATCGTTGCAATCGCAGTATTTCAGTCATACAGGAAAGTTGGTCTGAGGCGGCCTAAATAAGAGAAG AAGAAGACCTACTCCCTTTATTAAGTGTTTGGCCTCCTTACAAAGACGCAAGCGTCTTGCTAGTACGTAAACCTACT TCATTAGAAGTAGATCGAGGTTCGAGTAACGCTACTCCGCTTCTTAACACAATTAATATAGTCTCACCTAAACTAGG CTCTTTAGCAGCTAAAGTCTATCCTTGCCGGAITCTCCAAGACCCACCCAAG。具體改造方法為本領(lǐng)域常規(guī) 技術(shù)，可參見文獻(xiàn)（Smith,N.A.，Singh,S.P.，Wang,M.B.，Stoutjesdijk,P.A.， Green,A.G. , &Waterhouse,P.M. (2000).Geneexpression:Totalsilencingby intron-splicedhairpinRNAs.Nature, 407(6802), 319-320)。其中，優(yōu)選按下述方法 構(gòu)建質(zhì)粒pBHg-dsACO: 質(zhì)粒pBHg-dsACO由雙孢蘑菇基因⑶S部分序列雙鏈RNA(dsRNA)的表達(dá)框插入質(zhì) 粒pBHg的多克隆位點處構(gòu)建而成。雙孢蘑菇基因⑶S部分序列dsRNA表達(dá)框由四個 DNA片段經(jīng)酶切酶連得到，四個DNA片段分別是雙孢蘑菇3-磷酸甘油脫氫酶基因啟動 子、雙孢蘑菇^6基因CDS部分正向序列S-AC0、雙孢蘑菇基因CDS部分反向序列R-AC0 和CaMV35S基因的終止序列T35S。S-AC0和R-AC0二者有248bp的重復(fù)序列。沿啟動子 的PCR擴(kuò)增使用的引物是GPD-U、GPD-D(表1)，模板是質(zhì)粒pBHg，PCR擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變 性 5min，94°C40s、55°C1min、72°C1min共 30 個循環(huán)，72°C延伸 10min。擴(kuò)增S-AC0 和R-AC0使用的引物是S-AC0-U、S-AC0-D和R-AC0-U、R-AC0-D，依據(jù)雙孢蘑菇AS2796J⑶ 基因cDNA序列（GeneBank登錄號JQ314344. 1)設(shè)計，模板是雙孢蘑菇AS2796的總RNA經(jīng) 米用MMLVReverseTranscriptaselst-StrandcDNASynthesisKit合成的cDNA。PCR 擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性 5min，94°C40s、56°C1min、72°C1min共 30 個循環(huán)，72°C延伸 10min。T35S擴(kuò)增使用的引物是T35S-U、T35S-D(表1)，模板是質(zhì)粒pBHg，PCR擴(kuò)增條件： 94°C預(yù)變性 5min，94°C40s、55°C1min、72°C1min共 30 個循環(huán)，72°C延伸 10min。
【主權(quán)項】
1. 一種脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 采摘菌褶未破的幼嫩雙孢蘑菇子實體，清潔表面后，收集菌褶組織并切成塊，獲得菌 褶組織塊； 2) 將脂質(zhì)體 Lipofectamine ? 2000 和質(zhì)粒 pBHg-dsACO 混勻，于-5 - 5°C 放置 15 - 60 min ； 3) 將步驟2)產(chǎn)物用無菌超純水稀釋1000倍，然后與步驟1)菌褶組織塊混勻，室溫放 置 80 - 120 min ; 4) 將步驟3)所得產(chǎn)物加入到RCM固體培養(yǎng)基中，20 - 30°C培養(yǎng)8 - 12d ; 5) 將萌發(fā)的雙孢蘑菇菌褶組織塊轉(zhuǎn)移到含潮霉素的PDA平板上，20 - 30°C培養(yǎng)10 - 20d ； 6) 切下新生長的菌絲塊移植到PDA斜面進(jìn)行培養(yǎng)，如此傳代培養(yǎng)2 - 5次，再轉(zhuǎn)接到含 潮霉素的PDA平板上，能夠正常生長的即為轉(zhuǎn)化子。
2. 如權(quán)利要求1所述脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶的方法，其特征在于，所述步驟2) 中將 I KL 脂質(zhì)體 Lipofectamine ? 2000 和 2 - 3 Kg 質(zhì)粒 pBHg-dsACO 混勻。
3. 如權(quán)利要求1所述脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶的方法，其特征在于，所述步驟4) 中的RCM固體培養(yǎng)基組成為：胰蛋白胨2.0 g，酵母提取物2.0 g，MgS04*7H20 0. 5 g，K2HP04 0.46 g，KH2PO4 I g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，甘露醇 109.3 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.0。
4. 如權(quán)利要求1所述脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶的方法，其特征在于，所述步驟5) 和6)中的PDA平板含潮霉素濃度為20 - 100 μ g/mL。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶的方法，具體為：1）采摘菌褶未破的幼嫩蘑菇子實體，清潔表面后，收集菌褶組織并切成塊；2）將脂質(zhì)體和質(zhì)?；靹颍?5－5℃放置15－60min；3）將步驟2）產(chǎn)物用無菌超純水稀釋1000倍，與菌褶組織塊混勻，室溫放置80－120min；4）將步驟3）所得產(chǎn)物加入到RCM固體培養(yǎng)基中，室溫培養(yǎng)8－12d；5）將萌發(fā)的雙孢蘑菇菌褶組織塊轉(zhuǎn)移到含潮霉素的PDA平板上，室溫培養(yǎng)10－20d；6）切下新生長的菌絲塊移植到PDA斜面培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)2－5次，再轉(zhuǎn)接到含潮霉素的PDA平板上，能夠正常生長的即為轉(zhuǎn)化子。該方法具有操作簡便、轉(zhuǎn)化率高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定等優(yōu)點。
【IPC分類】C12N15-80
【公開號】CN104651389
【申請?zhí)枴緾N201410832003
【發(fā)明人】邱立友, 劉冬忍, 張朝輝, 高玉千, 戚元成, 申進(jìn)文
【申請人】河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年12月29日