用于鑒定日本血吸蟲(chóng)感染釘螺的q-pcr引物、鑒定方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地涉及用于鑒定日本血吸蟲(chóng)感染釘螺的Q-PCR 引物、鑒定方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 日本血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人體健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病，預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感 染是當(dāng)前公共衛(wèi)生最為重要的工作之一，據(jù)2011年全國(guó)血吸蟲(chóng)病疫情通報(bào)顯示，全國(guó)推算 血吸蟲(chóng)病人286836例，其中晚期血吸蟲(chóng)病患者30028例。有效防控疫區(qū)血吸蟲(chóng)感染對(duì)經(jīng)濟(jì) 社會(huì)穩(wěn)定至關(guān)重要。
[0003] 釘螺是日本血吸蟲(chóng)唯一的中間宿主，在我國(guó)長(zhǎng)江流域分布較廣，尤其是湖南、湖 北、江西、安徽、江蘇等省，其對(duì)血吸蟲(chóng)的傳播與疫區(qū)血吸蟲(chóng)病的流行起到關(guān)鍵的作用，在血 吸蟲(chóng)病傳播與防治及公共衛(wèi)生方面有重要價(jià)值，因此，能夠?qū)﹂L(zhǎng)江流域釘螺的鑒定，可以直 觀的反映血吸蟲(chóng)病流行區(qū)的流行狀況，更好的指導(dǎo)日本血吸蟲(chóng)病防控。
[0004] 目前，陽(yáng)性釘螺的鑒定方法主要以壓碎螺體、顯微鏡下觀察是否有蝴體為判定標(biāo) 準(zhǔn)。此方法對(duì)技術(shù)人員要求較高，而且準(zhǔn)確率較低，容易出現(xiàn)鑒別錯(cuò)誤；而釘螺感染后，由于 血吸蟲(chóng)發(fā)育需要時(shí)間，顯微鏡檢最早的時(shí)間在9天，特別是現(xiàn)場(chǎng)采集的釘螺，也需要在實(shí)驗(yàn) 室飼養(yǎng)一段時(shí)間，才能夠通過(guò)顯微鏡判定，時(shí)效性太差，不能滿足當(dāng)前血防工作的需求。
[0005] 因此，需要開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單方便、人為因素干擾少的能夠快速、準(zhǔn)確鑒別陽(yáng)性釘螺的 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種日本血吸蟲(chóng)感染釘螺 鑒定用Q-PCR引物、鑒定方法與試劑盒，可以能夠快速、準(zhǔn)確鑒別陽(yáng)性釘螺，具有簡(jiǎn)單方便、 人為因素干擾少的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供一種用于鑒定日本血吸蟲(chóng)感染釘螺 的Q-PCR引物，其特征在于，所述Q-PCR引物為：
[0008]上游引物PF:5 ' -GGTCCATGTTTGGGTGGAGT-3 '
[0009]下游引物PR: 5' -AITCGGGTGITCTTGAGGCT-3 '。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了利用權(quán)利要求1所述的引物鑒定日本血吸蟲(chóng)感染釘螺的方 法，包括如下步驟：
[0011] (1)抽提總RNA;
[0012] (2)逆轉(zhuǎn)錄：日本血吸蟲(chóng)基因的序列如SEQNO1所示，利用試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;所述試劑盒為商品化試劑盒（ThermoScript?RT-PCRSystem，Cat no. 11146-024)，包括trizol、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR反應(yīng)緩沖液等；
[0013] (2)Q-PCR擴(kuò)增：以步驟⑵中的cDNA為總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所示的 Q-PCR引物采用試劑盒（GeneCoreCatNo. 106-8758-1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用熒光定量PCR儀器進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線在25個(gè)循環(huán)以下（即Ct值小于25)出現(xiàn)上升峰，擴(kuò)增產(chǎn)物為 274bp即判定為陽(yáng)性。
[0014] 其中，步驟（2)中，Q-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系為：2~10ng/ul的模板DNA25ul ;上游引 物和下游引物濃度均為lug/ul，各lul ;PCR反應(yīng)緩沖液；10XSYBE Green染料5ul，5XNTP 10ul，加水至50ul總反應(yīng)體積。
[0015] 步驟⑵中，Q-PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性45s， 72°C延伸30s，總共40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。
[0016] 步驟（2)中，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQN0 2所示。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了一種用于鑒定日本血吸蟲(chóng)感染釘螺的試劑盒，該試劑盒包括 權(quán)利要求1所述的Q-PCR引物。
[0018] 本發(fā)明還提出了上述Q-PCR引物或上述的試劑盒在日本血吸蟲(chóng)感染釘螺鑒定中 的應(yīng)用。
[0019] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用日本血吸蟲(chóng)特有的A基因序列合理設(shè)計(jì) PCR引物，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增以及擴(kuò)增曲線判讀，鑒定釘螺是否為日本血吸蟲(chóng)陽(yáng)性感 染，具有操作簡(jiǎn)單、程序化高、鑒定快速和結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，避免傳統(tǒng)顯微鏡下解剖鑒定方 法耗時(shí)耗力、可重復(fù)性差和人為干擾因素大等缺點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】 圖1為實(shí)施例1Q-PCR擴(kuò)增曲線的示意圖； 圖2為凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1日本血吸蟲(chóng)感染釘螺的鑒定方法。
[0021] 實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)釘螺共100只，其中人工感染釘螺50只，未感染對(duì)照50只。應(yīng)用 Trizol結(jié)合RNA提取試劑盒抽提總RNA ;
[0022] 利用存在于日本血吸蟲(chóng)的A基因序列合理設(shè)計(jì)一對(duì)Q-PCR引物，Q-PCR引物序列 為：
[0023]上游引物PF:5 ' -GGTCCATGTTTGGGTGGAGT-3 '
[0024]下游引物PR:5 ' -AITCGGGTGTTCTTGAGGCT-3。
[0025] 其中，A基因的序列為SEQN01所示，其是根據(jù)人的基因序列設(shè)計(jì)引物在蟲(chóng)上克隆 出的，克隆所用引物為：
[0026]上游引物PF :5' -tcagAAGCTT ATGGGGCGTACTGATACATTTG-3'；
[0027]下游引物PR :5' -actg AGATCT TTATAATCCCCGAGTTAGTAAG-3'；
[0028] 克隆的產(chǎn)物長(zhǎng)度為950bp，經(jīng)驗(yàn)證該序列確實(shí)存在且序列正確。
[0029]利用試劑盒（ThermoScript?RT-PCRSystem，Catno. 11146-024,包括trizol、 dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR反應(yīng)緩沖液等）用一步法將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以上述cDNA 為總DNA模板，利用Q-PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：采用試劑盒（GeneCoreCat No. 106-8758-1)，Q-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系為：10ng/ul的模板DNA2ul;上游引物和下游引 物濃度均為 200nM，各 2ul;SYBRGreenPCRMasterMix反應(yīng)緩沖液（2X)10ul;ddH20 4ul20ul總反應(yīng)體積，其反應(yīng)的程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性45s，72°C延 伸30s，總共40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。
[0030] 根據(jù)擴(kuò)增曲線以及Ct值計(jì)算判斷釘螺感染與否，擴(kuò)增曲線的Ct值在15和25之 間，都是為有效擴(kuò)增，若Ct值大于25,則沒(méi)有特異性的擴(kuò)增，PCR陰性；若Ct值小于25,則 判定為陽(yáng)性感染螺（如圖1所示）。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳，在泳道內(nèi)顯示一條核苷酸序列為 274bp特異性條帶，鑒定結(jié)果與顯微鏡檢測(cè)結(jié)果一致，見(jiàn)表1。
[0031] 表1實(shí)驗(yàn)室感染釘螺檢測(cè)結(jié)果
[0032]
[0033] 實(shí)施例2
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于鑒定日本血吸蟲(chóng)感染釘螺的Q-PCR引物，其特征在于，所述Q-PCR引物為： 上游引物 PF :5' -GGTCCATGTTTGGGTGGAGT-3' 下游引物 PR :5' -ATTCGGGTGTTCTTGAGGCT-3'。
2. -種利用權(quán)利要求1所述的引物鑒定日本血吸蟲(chóng)感染釘螺的方法，其特征在于，包 括如下步驟： (1) 抽提總RNA ; (2) 逆轉(zhuǎn)錄：日本血吸蟲(chóng)基因 A的序列如SEQ NO 1所示，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆 轉(zhuǎn)錄為cDNA ; (2) Q-PCR擴(kuò)增：以步驟（2)中的cDNA為總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所示的Q-PCR 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用熒光定量PCR儀器進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線在25個(gè)循環(huán)出現(xiàn)上升 峰，擴(kuò)增產(chǎn)物為274bp即判定為陽(yáng)性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，Q-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系為： 10ng/ul 的模板 DNA2ul ;200nM 上游引物 2ul ;200nM 下游引物 2ul ;2XSYBR Green PCR Master Mix反應(yīng)緩沖液IOul ;ddH20 4ul ;加水至20ul總反應(yīng)體積。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，Q-PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?5°C預(yù) 變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性45s，72°C延伸30s，總共40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列 如SEQ NO 2所示。
6. -種用于鑒定日本血吸蟲(chóng)感染釘螺的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的 Q-PCR引物。
7. 權(quán)利要求1所述的Q-PCR引物或權(quán)利要求6所述的試劑盒在日本血吸蟲(chóng)感染釘螺鑒 定中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于鑒定日本血吸蟲(chóng)感染釘螺的Q·PCR引物，同時(shí)提出了利用該引物鑒定日本血吸蟲(chóng)感染釘螺的方法。本發(fā)明利用日本血吸蟲(chóng)特有的A基因序列合理設(shè)計(jì)PCR引物，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增以及擴(kuò)增曲線判讀，鑒定釘螺是否為日本血吸蟲(chóng)陽(yáng)性感染，具有操作簡(jiǎn)單、程序化高、鑒定快速和結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，避免傳統(tǒng)顯微鏡下解剖鑒定方法耗時(shí)耗力、可重復(fù)性差和人為干擾因素大等缺點(diǎn)。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104651489
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410781275
【發(fā)明人】黃玉政, 劉坤
【申請(qǐng)人】江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所
【公開(kāi)日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2014年12月16日