一種用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的探針、試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)用的探針，具體涉及一種用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的探針、試劑 盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 食品細(xì)菌即指常在食品中存在的細(xì)菌，自然界的細(xì)菌種類繁多，但由于食品理化 性質(zhì)，所處環(huán)境條件及加工處理等因素的限制，在食品中存在的細(xì)菌只是自然界細(xì)菌的一 小部分。食品細(xì)菌包括致病菌和非致病菌：致病菌是指隨食物進(jìn)入人體后可引起食源性疾 病，常見者如沙門氏菌、志賀氏菌等，與疾病直接有關(guān)，一般規(guī)定在食品中不允許檢出。非致 病菌一般不引起人類疾病，但其中一部分為腐敗菌，如假單胞菌，與食品變質(zhì)有密切關(guān)系， 是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)。
[0003] 在我國的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中，測(cè)定食品中細(xì)菌數(shù)量的方法，是在嚴(yán)格規(guī)定的培養(yǎng)方 法和培養(yǎng)條件下進(jìn)行的，使得適應(yīng)這些條件的每一個(gè)活菌細(xì)胞能夠生成一個(gè)肉眼可見的菌 落，所生成的菌落總數(shù)即是該食品中的細(xì)菌總數(shù)。食品中細(xì)菌的種類很多，它們的生理特性 和所需要的培養(yǎng)條件不盡相同。如果要采用培養(yǎng)的方法計(jì)數(shù)食品中所有的細(xì)菌種類和數(shù) 量，必須采用不同的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，其工作量很大，通常會(huì)采用檢測(cè)指標(biāo)菌的方法來替 代。
[0004] 例如，腸道致病菌如沙門氏菌屬和志賀氏菌屬是引起食物中毒的重要致病菌，然 而這些致病菌往往數(shù)量較少且難以培養(yǎng)，對(duì)食品進(jìn)行逐批逐件地檢驗(yàn)又不可能，鑒于大腸 菌群與腸道致病菌來源相同，而且一般在外環(huán)境中生存時(shí)間也與主要腸道病原菌一致，所 以大腸菌群通常就作為腸道病原菌污染食品的指示菌。通過檢測(cè)指標(biāo)菌來大致判斷食品中 的致病菌存在狀況，不失為一種簡(jiǎn)便方法，但很顯然，指標(biāo)菌和病原菌的存在并非完成平行 的關(guān)系一一食品中檢出大腸菌群，只能說明有腸道病原菌存在的可能性，食品中未檢測(cè)大 腸菌群，也不能完全排除食品中可能有腸道病原體污染。
[0005] 由此可見，當(dāng)前的食品細(xì)菌檢測(cè)方法并不能很好地滿足簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)需 求，對(duì)于難培養(yǎng)、難鑒定的食品源致病菌，需要更高效的檢測(cè)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種探針，所述探針能 用于檢測(cè)食品中細(xì)菌，通過熒光原位雜交的手段，本發(fā)明還提供了一種快速、靈敏、特異性 地檢測(cè)食物中常見細(xì)菌的試劑盒和方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的探針，所述探針 呈分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)，即探針序列由莖、環(huán)兩部分組成，總長(zhǎng)度25~60個(gè)堿基，其中中間的環(huán)序 列部分與細(xì)菌16srRNA或23srRNA序列相匹配，兩端莖部分是5~8個(gè)互補(bǔ)的DNA或PNA 序列，探針在常溫下會(huì)自動(dòng)退火形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；探針的5'端用熒光基團(tuán)標(biāo)記，3'端用熒光 淬滅基團(tuán)標(biāo)記，常態(tài)下游離的探針由于呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)因緊挨熒光淬滅基團(tuán)，而不會(huì) 有熒光發(fā)出，只有當(dāng)探針與靶序列成功雜交上之后，熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離開來，才 會(huì)發(fā)出熒光；
[0008] 所述探針是通過核酸雜交的原理檢測(cè)食品中的細(xì)菌的，所述細(xì)菌包括食品中正常 攜帶的細(xì)菌以及食品被污染后帶上的致病菌。
[0009] 優(yōu)選地，所述探針5'端的熒光基團(tuán)為FITC、FAM和Cy3中的一種，所述探針3'端 的熒光淬滅基團(tuán)為DABCYL、BDH和TANRA中的一種。
[0010] 本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的試劑盒，所述試劑盒包括：
[0011] ⑴上述所述的探針；
[0012] (2)重懸固定液；
[0013] (3)雜交液；
[0014] (4)洗滌液；
[0015] 所述重懸固定液包括：
[0016]
[0017]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的探針，其特征在于：所述探針呈分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)，即探針 序列由莖、環(huán)兩部分組成，總長(zhǎng)度25~60個(gè)堿基，其中中間的環(huán)序列部分與細(xì)菌16s rRNA 或23s rRNA序列相匹配，兩端莖部分是5~8個(gè)互補(bǔ)的DNA或PNA序列，探針在常溫下會(huì) 自動(dòng)退火形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；探針的5'端用熒光基團(tuán)標(biāo)記，3'端用熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記，常態(tài)下 游離的探針由于呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)因緊挨熒光淬滅基團(tuán)，而不會(huì)有熒光發(fā)出，只有當(dāng)探 針與靶序列成功雜交上之后，熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離開來，才會(huì)發(fā)出熒光； 所述探針是通過核酸雜交的原理檢測(cè)食品中的細(xì)菌的，所述細(xì)菌包括食品中正常攜帶 的細(xì)菌以及食品被污染后帶上的致病菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的探針，其特征在于，所述探針5'端的 熒光基團(tuán)為FITC、FAM和Cy3中的一種，所述探針3'端的熒光淬滅基團(tuán)為DABCYL、BDH和 TANRA中的一種。
3. -種用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (1) 權(quán)利要求1或2中所述的探針； (2) 重懸固定液； (3) 雜交液； (4) 洗滌液； 所述重懸固定液包括： Tris-HCl 50-150 mMpHS.O, DMSO 3% ~10%(v/v)， CaCl2 5~20 raM， DEPC 0·1%~1%(v/v)， β-巰基乙醇 1%~5% ( v/v), 曱醇 20% ~45% (v/v)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的試劑盒，其特征在于，所述雜交液包 括 5% (w/v)PEG，50mM NaCl，40% (v/v)甲酰胺，0.5% (w/v)過硫酸按，1% (w/v)DEPC，l% (w/v)聚蔗糖，50mM EDTA，0. 1% (v/v)TritonX-100,50mM pH 8.0 的 Tris-HCl ; 所述洗滌液包括 50mM pH 10. 0 的 Tris-HCl，0. 5M NaCl，0. 1% (v/v)ΝΡ-40,0· 5% (v/ ν)Triton Χ-100。
5. -種采用如權(quán)利要求3-4任一所述試劑盒的用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的方法，其特征在 于，所述方法包括以下步驟： (Ia)取待檢食品樣品，加入到重懸固定液中，震蕩混勻； (2a)取步驟（Ia)中混勻后的液體滴在載玻片上，然后烘干； (3a)將步驟（2a)中獲得的載玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干； (4a)在浸泡后的載玻片上的待檢位置加入雜交液和探針，置于雜交爐中避光雜交； (5a)將步驟（4a)中獲得的載玻片浸入預(yù)熱的洗滌液中洗滌，然后烘干； (6a)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用IOX物鏡掃視和計(jì)數(shù)，用40或100X物鏡 觀察細(xì)菌形態(tài)； 或者所述方法包括以下步驟： (Ib)取待檢食品樣品，加入到重懸固定液中，震蕩混勻； (2b)過濾得到濾液； (3b)取步驟（2b)中得到的濾液滴在載玻片上，然后烘干； (4b)將步驟（3b)中獲得的載玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干； (5b)在浸泡后的載玻片上的待檢位置加入雜交液和探針，置于雜交爐中避光雜交； (6b)將步驟（5b)中獲得的載玻片浸入預(yù)熱的洗滌液中洗滌，然后烘干； (7b)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用IOX物鏡掃視和計(jì)數(shù)，用40或IOOX物鏡 觀察細(xì)菌形態(tài)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（la)、（Ib)中所述待檢食品樣品 與所述重懸固定液的體積比為1:1~1:5,所述步驟（2a)中所述液體滴加的體積為10 μ L， 所述步驟（3b)中所述濾液滴加的體積為10yL，所述步驟（2a)、（3a)、（5a)、（3b)、（4b)、 (6b)中的烘干溫度為52°C，所述步驟（3a)、（4b)中所述浸泡時(shí)間為5分鐘，所述步驟（5a)、 (6b)中洗滌液的預(yù)熱溫度為55°C，所述步驟（5a)、（6b)中所述洗滌時(shí)間為5分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（3a)、（4b)中所述雜交液的加 入體積為20 μ L，所述探針加入后的終濃度為20ng/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（3a)、（4b)中雜交溫度為52°C， 雜交時(shí)間為30分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的探針，該探針為分子信標(biāo)探針，未與靶位點(diǎn)雜交上時(shí)呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不會(huì)發(fā)出熒光，只有與靶位點(diǎn)特異性地結(jié)合后，才有熒光產(chǎn)生；本發(fā)明還提供了一種快速檢測(cè)食品中細(xì)菌的方法，本發(fā)明的檢測(cè)方法信號(hào)強(qiáng)度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，可以高效、快速地檢測(cè)食品中的細(xì)菌；本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)食品中細(xì)菌的試劑盒。
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-10, C12R1-19, C12Q1-04, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104651512
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510080114
【發(fā)明人】方國偉, 洪冉, 劉振世, 易春
【申請(qǐng)人】蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日