用于禽流感病毒檢測的rt-lamp引物組、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及禽流感病毒的檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感（AvianInfluenza,AI)又稱"真性雞瘟"或"歐洲雞瘟"，是由禽流感病毒 (AvianInfluenzavirus,AIV)引起的禽類傳染病。主要發(fā)生于雞、鴨、鵝、纟鳥子等，人也可 感染。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可分為高致病性、低致病性和非致病性禽流感。其中高致病性禽流 感因其傳播快、危害大，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫 病。AIV檢測方法主要包括：病毒分離、RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR。這些方法在病毒檢測中 發(fā)揮了重要作用，但普遍存在操作繁瑣、檢測周期長、需要昂貴的儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，不適用 于基層或現(xiàn)場的快速檢測。
[0003]逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ReverseTranscriptionLoop-Mediated IsothermalAmplification,RT-LAMP)專門用于快速擴(kuò)增RNA。其基本原理是采用4或6 條特異引物和具有鏈置換功能的DNA聚合酶，在等溫條件下對核酸進(jìn)行擴(kuò)增，不需要特殊 儀器設(shè)備，檢驗(yàn)周期很短，在一小時(shí)內(nèi)即可完成反應(yīng)。反應(yīng)完成后，只需通過其副產(chǎn)物白色 的焦磷酸鎂沉淀來觀察結(jié)果，或者預(yù)先加入熒光染料，通過肉眼觀察就能判斷結(jié)果。
[0004]RT-LAMP方法具有簡便、快速、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)，尤其適合在基層或現(xiàn)場進(jìn)行快速 檢測。RT-LAMP技術(shù)中，引物是決定檢測結(jié)果靈敏度和特異性的關(guān)鍵因素。目前亟需建立一 種能夠靈敏、特異、高效檢測禽流感病毒的RT-LAMP檢測手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述問題，本發(fā)明根據(jù)GenBank公布的禽流感病毒序列，在其M基因保守序列 區(qū)域設(shè)計(jì)了一套通用的RT-LAMP特異性引物，如表1所示。這些基因序列涵蓋了多種家禽 及野鳥來源的禽流感病毒的M基因，具有普遍性和代表性。
[0006] 利用該引物建立的RT-LAMP檢測對在我國主要存在的H5、H7和H9亞型禽流感 病毒以及新城疫病毒等其他4種禽病病原進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該引物組僅能特異性擴(kuò)增 禽流感病毒基因，而不能擴(kuò)增其他病毒基因，具有很好的特異性。
[0007] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題之一是提供了一種用于禽流感病毒檢測的RT-LAMP引 物組，其特征在于：所述引物組由一對外引物和一對內(nèi)引物組成；所述外引物對序列為SEQ IDNo. 1和SEQIDNo. 2所示，所述內(nèi)引物對序列為SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示。
[0008]將SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4 所對應(yīng)的引物序列分 別命名為M-F3、M-B3、M-FIP、M-BIP。
[0009]所述引物143、]?-83、]\^71?、]\1-81?的摩爾比具體可為1:1 :5:5。
[0010] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述一對外引物（M-F3和M-B3)在RT-LAMP反應(yīng)體系 中的終濃度均為〇. 2iiM，所述一對內(nèi)引物（M-FIP和M-BIP)在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中 的終濃度均為1UM。
[0011] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題之二是提供了一種用于禽流感病毒檢測的RT-LAMP試 劑盒，包括RT-LAMP反應(yīng)液、鏈置換型DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶，其特征在于還包括以上所述 的引物組。
[0012] 優(yōu)選的，RT-LAMP反應(yīng)液由 10XBstDNABuffer、MgC12、dNTPs、無核酸酶水組 成；鏈置換型DNA聚合酶為BstDNA聚合酶；反轉(zhuǎn)錄酶由AMV反轉(zhuǎn)錄酶與RNA酶抑制劑組 成。
[0013] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括熒光顯色劑、陽性對照和陰性對照。
[0014] 其中，陽性對照可為禽流感病毒樣品；陰性對照可為滅菌超純水。
[0015] 優(yōu)選的，熒光顯色劑可為含有鈣黃綠素和MnC12的水溶液。
[0016] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括提取RNA的試劑：TRIzolLSReagent、氯仿、異丙醇、 75%乙醇、無核酸酶水。
[0017]如下1)或2)的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍： 1) 如上所述的引物組在制備所述試劑盒中的應(yīng)用； 2) 所述引物組或所述試劑盒在制備檢測待測樣品中是否含有禽流感病毒的產(chǎn)品中的 應(yīng)用。
[0018] 應(yīng)用所述引物組或所述試劑盒檢測待測樣品中是否含有禽流感病毒的方法，包括 如下步驟： 1、病毒RNA的提取 采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取禽流感病毒的RNA。具體步驟如下： (1)將250iiL樣本加入750iiLTRIzolLSRegent中，劇烈振蕩2min，室溫放置5 111；[11。加入 250 111^氯仿，劇烈振蕩1111；[11，室溫放置5111；[11后，41€ 12,000 印1]1離心15 111；[11， 將上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管。
[0019] (2)加入與水相等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置15min，4°C12, 000rpm離心15 min,輕輕倒去上清，然后加入DEPC處理的75%乙醇800iiL，4°C12,000rpm離心5min,棄 上清。
[0020] (3)將沉淀自然風(fēng)干或于50°C干燥箱中晾干，用適量無核酸酶的水充分溶解后立 即進(jìn)行RT-LAMP或貯存于-80°C備用。
[0021] 2、RT-LAMP反應(yīng) 在反應(yīng)管中依次加入13iiLRT-LAMP反應(yīng)液、6iiL引物組、2iiL上述RNA模板、1. 5iiL反轉(zhuǎn)錄酶、1.5iiLBstDNA聚合酶以及l(fā)iiL熒光顯色劑，制成25iiLRT-LAMP反應(yīng)體系， 其中6iiL引物組由0. 5iiL濃度為10剛的M-F3、0. 5iiL濃度為10剛的M-B3、2. 5iiL濃 度為10剛的M-FIP、2. 5yL濃度為10剛的M-BIP組成。混勻后將反應(yīng)管置于水浴鍋中， 62°C保溫 60min，80°ClOmin終止反應(yīng)。
[0022] 3、檢測 (1)直接觀察：反應(yīng)完成后立即觀察反應(yīng)液顏色變化。陽性樣品反應(yīng)液變?yōu)榫G色，陰性 樣品反應(yīng)液保持橙黃色不變。
[0023] (2)離心檢測：陽性樣品反應(yīng)后反應(yīng)管渾濁，陰性樣品反應(yīng)后反應(yīng)管澄清。4000rpm 離心5min后，陽性樣品反應(yīng)管可見白色的焦磷酸鎂沉淀，陰性樣品反應(yīng)管無沉淀。
[0024] (3)電泳檢測：用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物。陽性反應(yīng)呈現(xiàn)特有 的梯狀條帶，陰性反應(yīng)則無條帶出現(xiàn)。
[0025] 本發(fā)明使用熒光顯色劑作為指示劑，通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色就可以直接判定檢 測結(jié)果，避免了打開反應(yīng)管蓋后引起環(huán)境污染而造成下次實(shí)驗(yàn)的假陽性結(jié)果。本發(fā)明只需 一個(gè)可控溫的水浴鍋即可完成全部反應(yīng)，不需要貴重的熱循環(huán)儀。RT-LAMP擴(kuò)增速度快，可 在60min內(nèi)獲得結(jié)果；檢測靈敏度高，比普通PCR敏感性高100倍。
[0026] 本發(fā)明可對死亡的家禽或野鳥的腸內(nèi)容物、肺、氣囊、腸、脾、肝和心等組織以及活 體家禽或野鳥氣管拭子或泄殖腔拭子進(jìn)行禽流感病毒檢測，可供檢測的對象范圍廣，適用 性強(qiáng)。
[0027] 本發(fā)明根據(jù)GenBank公布的禽流感病毒序列，在其M基因保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)了一 套通用RT-LAMP特異性引物，這些基因序列涵蓋了多種家禽及野鳥的M基因，具有普遍性 和代表性。利用該引物建立的RT-LAMP檢測對在我國主要存在的H5、H7和H9亞型禽流 感病毒以及新城疫病毒等其他4種禽病病原進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該引物組僅能特異性擴(kuò)增 禽流感病毒基因，而不能擴(kuò)增其他病毒基因，具有很好的特異性。
[0028] 本發(fā)明特異性強(qiáng)、敏感性高、儀器設(shè)備及操作簡單、易于觀察結(jié)果，尤其適合在基 層及現(xiàn)場的快速檢測，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0029] 圖1為禽流感病毒RT-LAMP檢測結(jié)果； M:DL2000;1:無核酸酶水；2:禽流感病毒； 圖2為禽流感病毒RT-LAMP靈敏性檢測結(jié)果； A:RT-PCR;B:RT-LAMP； 1:DL2000; 2: 100; 3:KT1; 4:KT2; 5:KT3; 6:KT4; 7:KT5; 8: 1(T6;9:1(T7;10: KT8; 圖3為禽流感病毒RT-LAMP特異性檢測結(jié)果。
[0030]M:DL2000; 1:H5; 2:H7; 3:H9; 4:新城疫病毒；5:傳染性法氏囊病毒；6: 雞傳染性支氣管炎病毒；7:雞減蛋與呼吸綜合征病毒。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面參照附圖并結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是本發(fā)明不限于所 給出的例子。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例 中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 實(shí)施例1以RT-LAMP法檢測禽流感病毒的試劑盒最佳實(shí)施例 本實(shí)施例試劑盒包括以下RT-LAMP引物組，見表1。試劑盒分為A盒與B盒，A盒為RNA提取試劑盒，其試劑盒組成及保存條件見表2。B盒為禽流感病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (RT-LAMP)試劑盒，其試劑盒組成及保存條件見表3。
[0033]其中，RT-LAMP反應(yīng)液由 50uL10XBstDNABuffer、50uL濃度為 25mM的MgC12 溶液，60uL濃度為2. 5mM的dNTPs溶液，120uL無核酸酶水組成。
[0034] 反轉(zhuǎn)錄酶由20uL濃度為200U/ML的AMV反轉(zhuǎn)錄酶與10uL濃度為50U/ML的RNA 酶抑制劑組成。
[0035] 熒光顯色劑為含有鈣黃綠素和MnCl2的水溶液。
[0036] 陽性對照為禽流感病毒樣本，陰性對照為滅菌超純水。
[0037] 引物為水溶液，由50uL濃度為10剛的M-BIP引物、50uL濃度為10剛的M-FIP引 物、10uL濃度為10剛的M-F3引物與10uL濃度為10剛的M-B3引物組成。
[0038] 表1禽流感病毒RT-LAMP引物
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于禽流感病毒檢測的RT-LAMP引物組，其特征在于：所述引物組由一對外引 物和一對內(nèi)引物組成；所述外引物對序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)引物 對序列為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
2. -種用于禽流感病毒檢測的RT-LAMP試劑盒，包括RT-LAMP反應(yīng)液、鏈置換型DNA 聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶，其特征在于還包括權(quán)利要求1所述的引物組。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于禽流感病毒檢測的RT-LAMP試劑盒，其特征在于所述 RT-LAMP反應(yīng)液由10 X Bst DNA Buffer、MgCl2、dNTPs、無核酸酶水組成；所述鏈置換型 DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶；所述反轉(zhuǎn)錄酶由AMV反轉(zhuǎn)錄酶與RNA酶抑制劑組成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于禽流感病毒檢測的RT-LAMP試劑盒，其特征在于： 所述試劑盒還包括熒光顯色劑、陽性對照和陰性對照。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于禽流感病毒檢測的RT-LAMP試劑盒，其特征在于：所述 熒光顯色劑為含有鈣黃綠素和MnCl2的水溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于禽流感病毒檢測的RT-LAMP試劑盒，其特征在于： 所述試劑盒還包括提取RNA的試劑：TRIzol LS Reagent、氯仿、異丙醇、75%乙醇、無核酸酶 水。
7. 如下1)或2)的應(yīng)用： 1) 權(quán)利要求1所述的引物組在制備權(quán)利要求2所述試劑盒中的應(yīng)用； 2) 權(quán)利要求1所述的引物組或權(quán)利要求2所述的試劑盒在制備檢測待測樣品中是否 含有禽流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于禽流感病毒檢測的RT-LAMP引物組、試劑盒及其應(yīng)用。所述引物組由一對外引物和一對內(nèi)引物組成，所述外引物對序列為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述內(nèi)引物對序列為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，可有效檢測禽流感病毒。該試劑盒包括前述引物，可用于檢測禽流感病毒。本發(fā)明還提供了一種采用前述試劑盒進(jìn)行禽流感病毒檢測的方法，其檢測結(jié)果可直觀地根據(jù)反應(yīng)液顏色變化判斷，快速準(zhǔn)確。本發(fā)明具有檢測禽流感病毒特異性強(qiáng)、敏感性高、快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，尤其適用于現(xiàn)場和基層的檢測。
【IPC分類】C12R1-93, C12Q1-70, C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104651533
【申請?zhí)枴緾N201510077664
【發(fā)明人】袁萬哲, 劉聚祥, 孫繼國, 陳立功, 劉靜, 王庚南
【申請人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月13日