制備含有編碼在其反饋抑制中減弱或者消除的酶的基因的載體的方法及其用于制備氨基 ...的制作方法
【專利說明】制備含有編碼在其反饋抑制中減弱或者消除的酶的基因的 載體的方法及其用于制備氨基酸和核苷酸的用途
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備含有編碼在其反饋抑制中減弱或者消除的酶的基因的載體 的方法及其用于制備氨基酸和核苷酸的用途。
[0002] 氨基酸使用在人類醫(yī)學(xué)、制藥工業(yè)、食品工業(yè)和尤其是動物飼料中。氨基酸已知通 過發(fā)酵的方式從棒狀桿菌的細(xì)菌菌株，特別是谷氨酸棒狀桿菌，以及從腸桿菌菌株，特別是 大腸埃希氏桿菌中來制備。由于其巨大的重要性而不斷地要改善制備的工藝。制備工藝的 改良本身設(shè)計發(fā)酵技術(shù)上的措施實施，如攪拌和氧氣供給，或者培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成，如發(fā)酵 過程中的糖濃度或者產(chǎn)物形狀的后處理，通過例如離子交換層析法又或者微生物的內(nèi)在工 作性能。
[0003] 突變、選擇和突變體選擇的方法被采用來提高這些微生物的工作性能。通過該方 式可以獲得菌株，其耐受抗代謝物或者對于調(diào)節(jié)性重要的代謝物是營養(yǎng)缺陷型的，并生產(chǎn) 氨基酸。同樣采用了重組DNA技術(shù)來完善在L-氨基酸生產(chǎn)用的菌株，在此過程中擴增單個 氨基酸生物合成基因，并研究對氨基酸生產(chǎn)的影響。
[0004] 氨基酸的合成在微生物中通過合成路線完成，此路線稱為氨基酸生物合成路線或 者氨基酸合成路線或者也通稱為合成路線。這些合成路線由單個步驟組成，在每個步驟中 從前體中合成氨基酸。這些前體可在中心代謝中供使用。例如有丙酮酸、α-酮戊二酸、草 酰乙酸、戊糖磷酸、乙酰輔酶Α、赤蘚糖磷酸、磷酸烯醇丙酮酸或磷酸甘油酸。此外，由前體 通過所述合成路線合成氨基酸需要NADPH2、NH4+和還原的四氫葉酸。在棒狀桿菌的細(xì)菌和 腸桿菌中由前體通過所述合成路線合成氨基酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這適用于氨基酸 L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-蘇 氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、L-色氨 酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸和L-半胱氨酸。氨基酸合成在大腸埃希氏桿菌和谷 氨酸棒狀桿菌中被很好地研究。
[0005] 合成路線由一系列酶催化的反應(yīng)組成，此類酶催化的反應(yīng)受到嚴(yán)格地控制。特別 嚴(yán)格的控制通過反饋抗性酶進(jìn)行。在野生型菌株中，嚴(yán)格的控制機理防止代謝產(chǎn)物如氨基 酸超越本身需求的生產(chǎn)及其在培養(yǎng)基中的釋放。因此，從生產(chǎn)者的觀點看，過量生產(chǎn)有機化 學(xué)的化合物的菌株的構(gòu)建需要克服這些代謝控制。這些反饋抗性酶優(yōu)選合成路線的起始反 應(yīng)或者合成路線的分支點。在此，通常通過合成路線的最終產(chǎn)物進(jìn)行控制，這些最終產(chǎn)物即 氨基酸L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、 L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、 L-色氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸和L-半胱氨酸。
[0006] 也可以用中間體進(jìn)行控制，如0-乙酰絲氨酸、0-乙酰高絲氨酸、0-琥珀酰絲氨酸、 〇-琥珀酰高絲氨酸或腺苷蛋氨酸?？刂迫缦逻M(jìn)行：在上述氨基酸或者中間體的濃度增高時 合成路線的各種酶或者合成路線的反饋抗性酶被抑制。
[0007] 在表1中列舉了在現(xiàn)有技術(shù)中用于合成路線的酶和編碼其的基因的實例，該酶在 細(xì)胞中的形成通過反饋控制。此外，也給出了 EC編號，其就關(guān)鍵反應(yīng)的機理的底物和產(chǎn)物 方面表征了每個反應(yīng)。進(jìn)一步給出了對大腸埃希氏桿菌和谷氨酸棒狀桿菌野生型的控制的 反饋抗性酶的序列訪問編號。這些基因的核苷酸序列和編碼的多肽序列存放在公共數(shù)據(jù)庫 中。例如，谷氨酸棒狀桿菌在國立生物技術(shù)信息中心（NCBI)的國家醫(yī)學(xué)圖書館（Bethesda， MD, USA)數(shù)據(jù)庫內(nèi)，訪問編號NC_003450. 2和BX927148. 1至BX927157. 1。這些基因的 核苷酸序列和大腸桿埃希氏桿菌的編碼多肽序列由Blattner等人描述（Science 277 : 1453-1462 (1997))并存入國立生物技術(shù)信息中心（NCBI)的國家醫(yī)學(xué)圖書館（Bethesda， MD, USA)數(shù)據(jù)庫內(nèi)，訪問編號：NC_000913.2。也可通過海德堡UniProtKB/Swiss-Prot歐 洲分子生物學(xué)實驗室數(shù)據(jù)庫訪問。
[0008] 表1 :反饋抑制的酶的實例、表征其的酶分類號和編碼其的基因、以及示例性的大 腸埃希氏桿菌和谷氨酸棒狀桿菌的基因訪問編號
【主權(quán)項】
1. 制備含有編碼在其反饋抑制中減弱或者消除的酶的基因的載體的方法，其中 -將編碼反饋抑制的酶的基因在體外突變， -在接下來的步驟中連接入載體， -將載體分別在接下來的步驟中轉(zhuǎn)化入含有代謝物傳感器的微生物，該代謝物傳感器 在代謝物濃度升高時引起熒光蛋白的合成， -隨后選擇具有提高的熒光的微生物， -和從具有提高或最高的熒光的微生物中分離所述載體，該載體含有編碼在其反饋抑 制中減弱或消除的酶的基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 所述突變通過不定向突變來實現(xiàn)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的方法，其特征在于， 使用質(zhì)粒、插入元件、轉(zhuǎn)座子和/或噬菌體作為將編碼反饋抑制的酶的基因所連接入 的載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于， 使用的代謝物傳感器是選自pSenLys、pSenArg、pSenSer、pSenOAS、 pJCl-lrp-brnF-eyfp 的至少一種成分。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于， 使用的編碼反饋抑制的酶的基因是源自酵母或者細(xì)菌的基因。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的方法，其特征在于， 使用的編碼反饋抑制的酶的基因是2-異丙基蘋果酸合成酶、乙酰羥基酸合成酶、乙酰 谷氨酸合成酶、鄰氨基苯甲酸合成酶、天冬酰胺合成酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、天冬氨酸激 酶、ATP-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、氨甲酰磷酸合成酶、分支酸變位酶I、分支酸變位酶II、半胱氨 酸合成酶、D-3-磷酸甘油酸脫氫酶、3-脫氧-D-阿糖基庚糖酮酸-7-磷酸合成酶、二氫吡啶 二羧酸合成酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸激酶、高半胱氨酸轉(zhuǎn) 甲基酶、高絲氨酸〇-乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸〇-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、蛋氨酸合成 酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、預(yù)苯酸脫氫酶I、預(yù)苯酸脫氫酶II、吡咯啉-5-甲酸還原酶、核 糖1，5-雙磷酸激酶、絲氨酸乙?；?琥珀酰)轉(zhuǎn)移酶、蘇氨酸解氨酶或者酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的方法，其特征在于， 選擇具有最高熒光的微生物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項所述的方法，其特征在于， 將所述載體轉(zhuǎn)化入生產(chǎn)用微生物，該載體含有編碼在其反饋抑制中減弱或者消除的酶 的基因和在選擇之后從具有提商或最商的突光的微生物中分尚出來。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項所述的方法，其特征在于， 將編碼在反饋抑制中減弱或者消除的酶的基因連接入已經(jīng)用于生產(chǎn)所希望的產(chǎn)物并 且導(dǎo)致生產(chǎn)率額外提高的載體，和將該載體轉(zhuǎn)化入生產(chǎn)用菌株。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項所述的方法，其特征在于， 將編碼在反饋抑制中減弱或者消除的酶的基因引入到生產(chǎn)用菌株的染色體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項所述的方法，其特征在于， 將編碼在其反饋抑制中減弱或者消除的酶的基因或含有該基因的載體所轉(zhuǎn)化入的微 生物是細(xì)菌或者酵母。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項得到的載體或者基因用于生產(chǎn)氨基酸或者核苷酸的用 途。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于， 制備的氨基酸是選自L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-蘇 氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、脯氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-酪 氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸和L-半胱氨酸的至少一種成分。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于， 制備的核苷酸是選自乳清苷-5' _磷酸、5-磷酸核糖二磷酸或者肌苷-5' -磷酸的至少 一種成分。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制備含有編碼在其反饋抑制中減弱或者消除的酶的基因的載體的方法及其用于制備氨基酸和核苷酸的用途。根據(jù)本發(fā)明，將編碼反饋抑制的酶的基因在體外突變，-在接下來的步驟中連接入載體，-將載體分別在接下來的步驟中轉(zhuǎn)化入含有代謝物傳感器的微生物，該代謝物傳感器在代謝物濃度升高時引起熒光蛋白的合成，-隨后選擇具有提高或最高的熒光的微生物，-和從具有提高或最高的熒光的微生物中分離所述載體，該載體含有編碼在其反饋抑制中減弱或消除的酶的基因。
【IPC分類】C12N15-10, C12Q1-68, C12P13-00
【公開號】CN104662169
【申請?zhí)枴緾N201380044415
【發(fā)明人】G.申德齊洛茨, S.賓德, L.埃格林, M.博特
【申請人】于利奇研究中心有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2013年7月23日
【公告號】DE102012016716A1, EP2888372A1, WO2014029376A1