一種多肽菌素、其制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多膚菌素、其制備方法及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供具有免疫 提高促進(jìn)、細(xì)胞組織修復(fù)和/或抗菌促生長的作用的多膚菌素、其制備方法及其在制備抗 生素替代品或畜禽業(yè)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自Moore等（1946)首次報道，在飼料中添加抗生素能明顯提高肉雞的日增重W 來，人們對抗生素的研究和應(yīng)用越來越廣泛，先后有60余種抗生素應(yīng)用于畜牧業(yè)，在動物 疾病防治、提高飼料利用率、促進(jìn)畜禽生長等方面發(fā)揮了重要作用。但隨著抗生素的大量使 化特別是不科學(xué)地濫化細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等問題日益突出，引起世界各國政府及業(yè) 內(nèi)人±的高度重視。2006年，歐盟全面禁止了抗生素飼料添加劑的應(yīng)用。我國是畜禽生產(chǎn) 大國，由于抗生素在我國養(yǎng)禽業(yè)的大量使用，特別是不科學(xué)地濫用，導(dǎo)致藥物殘留超標(biāo)等問 題，出口量僅占生產(chǎn)量的0.9%~1.2%。
[0003] 養(yǎng)殖業(yè)中抗生素濫用的危害主要包括：
[0004] 1.導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性
[0005] 雖然耐藥性因子的傳遞頻率只有10-6,但由于細(xì)菌數(shù)量大、繁殖快，在該一頻率 下，仍造成抗藥菌株的擴散、蔓延，而且可W使一種細(xì)胞產(chǎn)生多種耐藥性?？股貫E用導(dǎo)致 耐藥菌株增加，而抗生素飼料添加劑長期、大量不合理使用是其中一條主要原因。畜牧業(yè) 中，大腸桿菌、葡萄球菌、沙口氏菌等過去并不嚴(yán)重或較少發(fā)生的細(xì)菌病，現(xiàn)已上升為家禽 的主要傳染病，該與長期濫用抗生素有直接關(guān)系。
[0006] 2.造成畜禽機體免疫力下降
[0007] 大量抗生素在其被攝入機體后，會隨血液循環(huán)分布到淋己結(jié)、腎、肝、脾、胸腺、肺 和骨骼等各組織器官，動物機體的免疫能力就被逐漸削弱，人和動物慢性病例增多，一些可 W形成終生堅強免疫的疾病頻頻復(fù)發(fā)。抗生素還會導(dǎo)致抗原質(zhì)量降低，直接影響免疫過程， 從而對疫苗的接種產(chǎn)生不良影響。
[0008] 3.引起畜禽內(nèi)源性感染和二重感染
[0009] 抗生素雖都有自己的抗菌譜，但基本都難W避免在作用于病原菌同時會影響機體 內(nèi)有益菌群生長，尤其是長期、大量使用，會造成機體內(nèi)菌群失調(diào)，微生態(tài)平衡破壞。潛伏在 體內(nèi)的有害菌趁機大量繁殖，而引起內(nèi)源感染。另外一種情況，抗生素會消滅體內(nèi)敏感菌， 在體內(nèi)一些微生物附著點上造成大量空位，為外界耐藥病菌乘虛而入提供機會，從而造成 外源感染。二重感染也是由于施用大量抗生素殺滅某種細(xì)菌時，破壞微生態(tài)平衡，另外一種 或多種內(nèi)源或外源病菌隨即再次感染機體造成的。
[0010] 4.在畜產(chǎn)品和環(huán)境中造成殘留
[0011] 抗生素被吸收到體內(nèi)后，分布到幾乎全身各器官，但大多數(shù)抗生素都難W透過機 體的幾個"天然屏障"，如血腦屏障、血睪屏障等?？股卦趦?nèi)臟器官尤其是肝臟內(nèi)分布較 多，而在肌肉和脂肪中分布較少?？股氐拇x途徑多種多樣，但大多數(shù)W肝臟代謝為主， 經(jīng)膽汁、由糞便排出體外；也會通過泌乳和產(chǎn)蛋過程殘留在乳和蛋中。一些性質(zhì)穩(wěn)定的抗生 素被排泄到環(huán)境中后仍能穩(wěn)定存在很長一段時間，從而造成環(huán)境中的藥物殘留。該些殘存 的藥物，通過畜產(chǎn)品和環(huán)境慢慢蓄積于人體和其它植物體中，最終W各種途徑匯集于人體， 導(dǎo)致人體產(chǎn)生大量耐藥菌株，失去對某些疾病的抵抗力，或因大量蓄積而對機體產(chǎn)生毒害 作用。
[0012] 因此，在全球經(jīng)濟一體化的時代，要提高我國畜禽產(chǎn)品的國際競爭力，抗生素安全 問題及對策研究已成為畜牧工作者的研究方向，尋找無公害的抗生素替代品已成為畜牧工 作者迫在眉睫的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供了一種可作為抗生素替代品的多膚（W下稱為多膚菌素），其具有免 疫提高促進(jìn)、細(xì)胞組織修復(fù)和/或抗菌促生長的作用。
[0014] 本發(fā)明提供的多膚菌素的氨基酸序列為；Gly-Ly s-Ser-Gln-Glu-Tyr-Leu-Gly。
[0015] 此外，本發(fā)明還提供了上述多膚的制備方法，其包括根據(jù)Fmoc-固相多膚合成法 合成粗品多膚，優(yōu)選的是，所述方法還包括使用反相高效液相色譜對所述粗品多膚進(jìn)行純 化。
[0016] 具體而言，所述Fmoc-固相多膚合成法中，W二氯樹脂（2-化lorotrit^ 化loride)為固相載體，HOBt (1-羥基-苯并-H氮哇）/TBTU (苯并H哇四甲基四氣測酸）/ DIEA (N，N'-二異丙基己胺））為催化劑，二甲基甲醜胺DMF為溶劑和清洗劑，H氣己酸 (TFA)/1，2-己二硫醇巧DTV&O為切割劑，進(jìn)行所述粗品多膚的合成。
[0017] 其中在合成時，所述方法使用分別使用下述氨基酸進(jìn)行合成：
[0018] Gly:Fmoc-Gly-〇H ；
[0019] Lys:Fmoc_Lys炬oc)-OH
[0020] Ser:Fmoc-Ser(tBu)-〇H
[0021] Gln:Fmoc_Gln (T;rt)-OH
[0022] Glu:Fmoc-Glu (01:Bu)-OH
[0023] Tyr:Fmoc-Tyr(Tbu)-〇H
[0024] Leu:Fmoc-Leu-〇H
[0025] 更具體而言，所述Fmoc-固相多膚合成的步驟包括：
[0026] a.用二甲基甲醜胺DMF浸泡所述二氯樹脂W將其活化；
[0027] b.根據(jù)Fmoc-固相多膚合成法，W二氯樹脂為固相載體，DIEA為催化劑，DMF為溶 劑，連接第一個氨基酸到樹脂；
[002引 C.用脈巧脫去Fmoc-基團(tuán)，使第一個氨基酸的氨基游離出來，恢復(fù)反應(yīng)活性；
[0029] d.可選地對樹脂進(jìn)行巧H麗顯色檢測，W鑒別Fmoc-基團(tuán)是否脫除W及氨基酸的 連接是否完全；
[0030] e.洗涂后用W H0BT\TBTU\DIEA為催化劑，DMF為溶劑及清洗劑，連接第二個氨基 酸；
[0031] f. W同樣方法連接其他的氨基酸；可選的是連接完每個氨基酸后都進(jìn)行巧H麗 顯色檢測，并且結(jié)果呈陰性時才可進(jìn)行下步反應(yīng)；
[0032] g.連接完所有氨基酸后洗涂，并用氮氣將樹脂吹干；
[0033] h.用切割試劑將膚從樹脂上切割下來；
[0034] i.將切下的膚再在冷己離中沉淀、洗涂、離也；
[00巧]j.凍干機中凍干獲得粗品。
[0036] 其中，純化時所述反相高效液相色譜條件為：
[0037] 多膚菌素純化條件為：W水-己膳為二元梯度洗脫流動相。流動相A為0. 1 % H氣己酸的水溶液，流動相B為0. 1 %H氣己酸的己膳溶液，色譜柱為C18反相色譜柱， 50*250mm，紫外檢測波長215nm，流速lOml/min，進(jìn)樣量10ml ;
[00測洗脫梯度：
[0039]
【主權(quán)項】
1. 一種多肽菌素，其特征在于，所述肽的氨基酸序列為Gly-Lys-Ser-Gln-Glu-Tyr-Le U-Gly 0
2. 權(quán)利要求1所述的多肽菌素的制備方法，其特征在于，所述方法包括根據(jù)Fmoc-固相 多肽合成法合成粗品多肽，優(yōu)選的是，所述方法還包括使用反相高效液相色譜對所述粗品 多肽進(jìn)行純化。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成法中，以二氯 樹脂為固相載體，H0Bt(l-羥基-苯并-三氮唑）/TBTU(苯并三唑四甲基四氟硼酸）/ DIEA(N，Ν'-二異丙基乙胺））為催化劑，二甲基甲酰胺DMF為溶劑和清洗劑，三氟乙酸 (TFA)/1，2-乙二硫醇（EDT)/Η20為切割劑，進(jìn)行所述粗品多肽的合成。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在合成時，所述方法使用分別使用下述氨基 酸進(jìn)行合成：Gly: Fmoc-Gly-OH Lys:Fmoc-Lys(Boc)-OH Ser:Fmoc-Ser(tBu)-OH Gln:Fmoc-Gln(Trt)-OH Glu:Fmoc-Glu(OtBu)-OH Tyr:Fmoc-Tyr(Tbu)-OH Leu:Fmoc-Leu-OH0
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成的步驟包括： a. 用二甲基甲酰胺（DMF)浸泡所述二氯樹脂以將其活化； b. 根據(jù)Fmoc-固相多肽合成法，以二氯樹脂為固相載體，DIEA為催化劑，DMF為溶劑， 連接第一個氨基酸到樹脂； c. 用哌啶脫去Fmoc-基團(tuán)，使第一個氨基酸的氨基游離出來，恢復(fù)反應(yīng)活性； d. 可選地對樹脂進(jìn)行茚三酮顯色檢測，以鑒別Fmoc-基團(tuán)是否脫除以及氨基酸的連接 是否完全； e. 洗滌后用以HOBT\TBTU\DIEA為催化劑，DMF為溶劑及清洗劑，連接第二個氨基酸； f. 以同樣方法連接其他的氨基酸；可選的是連接完每個氨基酸后都進(jìn)行茚三酮顯色 檢測，并且結(jié)果呈陰性時才可進(jìn)行下步反應(yīng)； g. 連接完所有氨基酸后洗滌，并用氮氣將樹脂吹干； h. 用切割試劑將肽從樹脂上切割下來； i. 將切下的肽再在冷乙醚中沉淀、洗滌、離心； j. 凍干機中凍干獲得粗品。
6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色譜條件為： 多肽菌素純化條件為：以水-乙腈為二元梯度洗脫流動相。流動相A為0. 1 %三氟乙 酸的水溶液，流動相B為0. 1%三氟乙酸的乙腈溶液，色譜柱為C18反相色譜柱，50*250mm， 紫外檢測波長215nm，流速10ml/min，進(jìn)樣量IOml ; 洗脫梯度： B : 5%-45% 30分鐘（制備純化） B:45%-90% 10分鐘（柱沖洗） B :90% 10分鐘（柱沖洗） B :5% 10分鐘（柱平衡）。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述粗品多肽的純度為85%以上，優(yōu)選87% 以上，并且所述反相高效液相色譜純化后的產(chǎn)品的純度為98 %以上。
8. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述切割試劑的體積比為TFA :EDT =H2O = 95:2. 5:2. 5〇
9. 權(quán)利要求1所述的多肽菌素在制備用于免疫提高促進(jìn)、細(xì)胞組織修復(fù)和/或抗菌促 生長的藥物中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1所述的多肽菌素在制備用于畜禽養(yǎng)殖的抗生素替代品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種多肽菌素、其制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽菌素，具有免疫提高促進(jìn)、細(xì)胞組織修復(fù)和/或抗菌促生長的作用。本發(fā)明提供的化學(xué)合成法簡便易行，能夠滿足畜禽業(yè)和市場的需要。同時滿足了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
【IPC分類】A61K38-08, A23K1-17, C07K1-20, A61P37-04, A61P31-14, C07K7-06, C07K1-06, A61P31-04, C07K1-04
【公開號】CN104672302
【申請?zhí)枴緾N201410794864
【發(fā)明人】呂志成, 楊賽, 鮑隆
【申請人】山東深海生物科技股份有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2014年12月18日