?？谔阋遖型多肽疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明設(shè)及一種牛A型口蹄疫 多膚疫苗，W及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫任oot and mouth disease,簡稱FMD)是一種偶蹄動(dòng)物發(fā)生的急性、高度接 觸性、發(fā)熱性傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛分布?？谔阋叩膫魅拘愿?，傳播迅速，感染豬、牛、羊 等牲畜后將導(dǎo)致幼畜死亡，成年動(dòng)物生產(chǎn)能力急劇下降，因此嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和肉 食及其畜產(chǎn)品的生產(chǎn)和供應(yīng)。目前，口蹄疫使動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的市場流通和國際貿(mào)易受到 極大的封鎖和限制，給流行國家和地區(qū)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV)感染引起的?？谔阋卟《緦儆诩?xì)小核糖核酸病毒， 具有多型性、易變性等特點(diǎn)。目前，已知全世界有7種血清型的口蹄疫病毒；A、0、C、Satl (南 非I型）、Sat2(南非II型）、Sat3(南非III型）和Asia I (亞洲I型）。該些主型中的 每一種又分若干亞型，目前發(fā)現(xiàn)的亞型已有70多種。血清型A、0、C和Asia I型的口蹄疫 病毒最為常見，其中血清型A病毒的變種最多，具有超過30種亞型。研究結(jié)果表明，口蹄疫 病毒的衣殼蛋白是由四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4組成的，每種各60個(gè)。VP1-VP3組 成衣殼蛋白亞單位，位于衣殼蛋白的外側(cè)，而VP4位于病毒顆粒的內(nèi)部。
[0004] 口蹄疫病毒各型之間的抗原性不同，彼此之間不能交互免疫。而且，在同一種血清 型中抗原差異的程度也很大，W至于能夠有效地抵抗一種亞型的口蹄疫疫苗可能針對(duì)同一 血清型中的另一種亞型沒有保護(hù)性。此外，口蹄疫毒株的抗原性還在不斷發(fā)生變化，隨著時(shí) 間的推移，原有疫苗的效力減弱甚至消失，因此給口蹄疫的防治工作帶來了很大的困難。
[0005] 當(dāng)前在我國牛群中流行的口蹄疫主要是0型、Asia I型和A型口蹄疫。我國對(duì)口 蹄疫實(shí)行強(qiáng)制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。但是，我國現(xiàn)行使用的口蹄疫疫 苗主要是病毒滅活疫苗，其存在著生物安全性差、副反應(yīng)大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。相比 之下，目前世界上很多國家已經(jīng)停止使用滅活疫苗，也禁止從使用滅活疫苗的國家進(jìn)口畜 產(chǎn)品。由此可見，在口蹄疫防治方面，我國已落后于世界發(fā)展形勢(shì)。
[0006] 在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亞單位疫苗、口蹄疫病毒載體疫 苗、口蹄疫基因工程修飾疫苗的研究報(bào)道，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在著諸 多問題，影響了該些新型疫苗的使用。此外，該些疫苗對(duì)于當(dāng)前已經(jīng)發(fā)生變異的流行毒株往 往效果較差，不能有效地保護(hù)動(dòng)物。因此，本領(lǐng)域仍然存在對(duì)于安全、有效的口蹄疫新型疫 苗的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備?？谔阋逜型多膚疫苗的抗原多膚，多膚組 合物，W及含有該多膚組合物的疫苗。
[000引為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了 W下技術(shù)方案：
[0009] 一方面，本發(fā)明提供一種用于制備牛口蹄疫A型膚疫苗的抗原多膚，含有序列5所 述的多膚片段。
[0010] 具體的，本發(fā)明提供的用于制備牛口蹄疫A型膚疫苗的抗原多膚，為a-d中任意一 項(xiàng)所述的多膚：
[0011] a.將序列1所示的多膚片段與序列5所述的多膚片段連接后獲得的多膚（多膚 1);
[0012] b.將序列2所示的多膚片段與序列5所示的多膚片段連接后獲得的多膚（多膚 2);
[0013] C.將序列3所示的多膚片段與序列5所示的多膚片段連接后獲得的多膚（多膚 3) ;
[0014] d.將序列4所示的多膚片段與序列5所示的多膚片段連接后獲得的多膚（多膚 4) 。
[0015] 本發(fā)明提供的用于制備?？谔阋逜型疫苗的多膚組合物，包括將序列1所示的多 膚片段與序列5所述的多膚片段連接后獲得的多膚（多膚1)。
[0016] 所述多膚組合物中還包括；下述1)-3)中所述多膚之一：
[0017] 1)將序列2所示的多膚片段與序列5所示的多膚片段連接后獲得的多膚（多膚 2);
[001引 2)將序列3所示的多膚片段與序列5所示的多膚片段連接后獲得的多膚（多膚 3) ;
[0019] 3)將序列4所示的多膚片段與序列5所示的多膚片段連接后獲得的多膚（多膚 4) 。
[0020] 本發(fā)明中所述的多膚及多膚片段可W是通過固相有機(jī)合成得到的膚物質(zhì)。
[0021] 所述序列5所述的多膚片段通過連接臂與序列1所述的多膚片段、序列2所述的 多膚片段、序列3所述的多膚片段或序列4所述的多膚片段連接，所述連接臂為甘氨酸或者 賴氨酸；當(dāng)所述連接臂為賴氨酸時(shí)，賴氨酸的e位氨基替代a位氨基形成膚鍵連接。
[0022] 優(yōu)選的，序列5所述的多膚片段與序列1所述的多膚片段、序列2所述的多膚片 段、序列3所述的多膚片段或序列4所述的多膚片段通過賴氨酸連接，所述序列1所述的多 膚片段、序列2所述的多膚片段、序列3所述的多膚片段或序列4所述的多膚片段的駿基端 與賴氨酸的e位氨基連接成膚鍵，賴氨酸的駿基與序列5所示多膚片段的氨基端連接成膚 鍵。
[0023] 具體的上述各個(gè)多膚的序列如下所示：
[0024] 多膚 1 ;
[00巧]RMEAAKTGKIAYDERRGk e K-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLG化
[0026] AARVAA化PASFNFGAIR (序列 1- e K-序列 5)
[0027] 多膚 2 ;
[00巧]RMEAKKTGKIAGDERRGk e K-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLG化
[0029] AARVAA化PASFNFGAIR (序列 2- e K-序列 5)
[0030] 多膚 3 ;
[003U KKGAGLAGVMVTESVGF服-e K-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGS
[003引 LAARVAA化PASFNFGAIR (序列 3- e K-序列 5)
[0033] 多膚 4 ;
[0034] KKGAGLTGVMYTESVRF服-e K-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGS
[0035] LAARVAA化PASFNFGAIR (序列 4- e K-序列 5)
[0036] 其中，eK為多膚片段之間的連接臂，即賴氨酸的e位氨基形成膚鍵，具體原理如 下所示：
[0037] 每個(gè)氨基酸至少包含一個(gè)"一COOH"(駿基）和一個(gè)"一畑3"(氨基），連接在a 碳原子上的駿基和氨基稱為"a駿基"和"a氨基"。一般的膚合成反應(yīng)為上一個(gè)氨基酸的 "a氨基"和下一個(gè)氨基酸的"a駿基"反應(yīng)形成酷胺鍵（膚鍵）而成。
[003引 Lys(賴氨酸）是一種堿性氨基酸，除了正常的"a氨基"和"a駿基"外，在e位 置上還有一個(gè)氨基，如下式。
[0039]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于制備牛口蹄疫A型肽疫苗的抗原多肽，含有序列5所述的多肽片段。
2. -種用于制備牛口蹄疫A型肽疫苗的抗原多肽，為a-d中任意一項(xiàng)所述的多肽： a. 將序列1所示的多肽片段與序列5所述的多肽片段連接后獲得的多肽； b. 將序列2所示的多肽片段與序列5所示的多肽片段連接后獲得的多肽； c. 將序列3所示的多肽片段與序列5所示的多肽片段連接后獲得的多肽； d. 將序列4所示的多肽片段與序列5所示的多肽片段連接后獲得的多肽。
3. -種用于制備?？谔阋逜型肽疫苗的多肽組合物，包括將序列1所示的多肽片段與 序列5所述的多肽片段連接后獲得的多肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽組合物，其特征在于：還包括：下述1)-3)中所述多肽之 1) 將序列2所示的多肽片段與序列5所示的多肽片段連接后獲得的多肽； 2) 將序列3所示的多肽片段與序列5所示的多肽片段連接后獲得的多肽； 3) 將序列4所示的多肽片段與序列5所示的多肽片段連接后獲得的多肽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的多肽組合物，其特征在于：所述序列5所述的多肽片段 通過連接臂與序列1所述的多肽片段、序列2所述的多肽片段、序列3所述的多肽片段或序 列4所述的多肽片段連接，所述連接臂為甘氨酸或者賴氨酸；當(dāng)所述連接臂為賴氨酸時(shí)，賴 氨酸的ε位氨基替代α位氨基形成肽鍵連接。 優(yōu)選的，序列5所述的多肽片段與序列1所述的多肽片段、序列2所述的多肽片段、序 列3所述的多肽片段或序列4所述的多肽片段通過賴氨酸連接，所述序列1所述的多肽片 段、序列2所述的多肽片段、序列3所述的多肽片段或序列4所述的多肽片段的羧基端與賴 氨酸的ε位氨基連接成肽鍵，賴氨酸的羧基與序列5所示多肽片段的氨基端連接成肽鍵。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽組合物，其特征在于：組成多肽組合物的多肽單鏈?zhǔn)孜?氨基酸殘基之間反應(yīng)共價(jià)連接形成環(huán)狀多肽或者所述多肽的單鏈中的兩個(gè)半胱氨酸的巰 基可以經(jīng)氧化連接在一起形成二硫鍵； 優(yōu)選地，所述多肽的單鏈?zhǔn)孜舶被釟埢矁r(jià)連接為羧基與氨基、或者羧基與羥基之 間反應(yīng)形成共價(jià)連接形成環(huán)狀多肽。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的多肽組合物，其特征在于：由將序列1所示的 多肽片段與序列5所述的多肽片段連接后獲得的多肽、將序列2所示的多肽片段與序列5 所示的多肽片段連接后獲得的多肽；將序列3所示的多肽片段與序列5所示的多肽片段連 接后獲得的多肽和將序列4所示的多肽片段與序列5所示的多肽片段連接后獲得的多肽組 成；優(yōu)選的，它們的摩爾比為（0. 5-1. 5) : (0. 5-1. 5) : (0. 5-1. 5) : (0. 5-1. 5);最優(yōu)選的，它 們的摩爾比為1 :1 :1 :1。
8. 權(quán)利要求1或2所述的抗原多肽以及權(quán)利要求3-7中任意一項(xiàng)所述的多肽組合物在 制備牛口蹄疫A型多肽疫苗或制備用于預(yù)防牛A型口蹄疫的生物制品中的應(yīng)用。
9. 一種牛A型口蹄疫多肽疫苗，包含權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的多肽組合物。
10. 牛口蹄疫A型多肽疫苗的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟： (1) 用注射用水將權(quán)利要求3-7中任意一項(xiàng)所述多肽組合物稀釋為10-100 μ g/ml的濃 度，從而得到多肽抗原水相； (2) 將佐劑滅菌； (3)在20~28°C條件下，按照所述多肽抗原水相與所述佐劑1 :1的體積比，先將佐劑 加入乳化罐內(nèi)，在90~150rpm下攪拌1. 5~3分鐘，然后緩慢加入多肽抗原水相，然后攪 拌20~30分鐘，再在8000~1000 Orpm下攪拌15~30分鐘，靜置3-10分鐘，分裝。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于制備?？谔阋逜型多肽疫苗的抗原多肽、多肽組合物及疫苗。多肽組合物包括將序列1所示的多肽片段與序列5所述的多肽片段連接后獲得的多肽。本發(fā)明的疫苗包括多肽組合物。本發(fā)明提供的牛口蹄疫A型合成肽疫苗具有良好的免疫效力，并且不會(huì)引發(fā)傳統(tǒng)疫苗存在的發(fā)熱、紅腫等問題，因此本發(fā)明的疫苗可以有效應(yīng)對(duì)目前口蹄疫病毒的抗原變異、不存在生物安全性，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明還提供了所述多肽和肽疫苗的制備方法以及其制藥用途。
【IPC分類】A61P31-14, A61K39-135, C07K14-00
【公開號(hào)】CN104672312
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510124702
【發(fā)明人】肖進(jìn), 宋芳, 齊鵬, 巴利民, 栗利芳, 王楠, 董春娜, 張蕾, 馬愛榮, 張愛民, 何平安
【申請(qǐng)人】中牧實(shí)業(yè)股份有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月20日