一種清液回流發(fā)酵蝦青素的培養(yǎng)基及方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵的技術領域，特別是提供了一種清液回流發(fā)酵蝦青素的方 法。
【背景技術】
[0002] 蝦青素是一種紅色脂溶性的類胡蘿卜素，被發(fā)現(xiàn)于小球藻、磷蝦、鮭魚等多種微生 物和海洋動物。它具有刺激免疫、防止癌變、消除自由基、抗氧化、保護肝臟及防止心血管疾 病[7]等特殊的生理功能，因而在食品添加劑、化妝品、保健品及醫(yī)藥工業(yè)方面的應用越來 越受到人們的重視。隨著對蝦青素需求量逐年加大，而化學方法合成的蝦青素存在一定的 安全性問題，所以從微生物（如紅法夫酵母、雨生紅球藻等）中提取天然蝦青素是現(xiàn)今該領 域的熱點研宄問題。
[0003] 蝦青素的發(fā)酵生產伴隨著大量廢水產生，這些廢水中存在著法夫酵母生物合成蝦 青素過程中，產生乙醇、丙酮酸等代謝副產物，而這些物質又能被法夫酵母所利用，因此利 用適宜濃度的發(fā)酵清液作為培養(yǎng)基培養(yǎng)法夫酵母發(fā)酵生產蝦青素，提高其對發(fā)酵液中營養(yǎng) 成分的利用率，且在獲得產物的同時降低成本減少廢液，特別是降低了環(huán)境污染。
[0004] 有鑒于此，本發(fā)明人研宄和設計了一種清液回流發(fā)酵蝦青素的方法，本案由此產 生。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種清液回流工藝發(fā)酵蝦青素的方法，通過利用發(fā)酵上清 液培養(yǎng)法夫酵母，保證蝦青素產量的同時，又可以大大降低工業(yè)廢水廢料的排放，減少了環(huán) 境污染。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術問題的技術方案是：
[0007] -種清液回流工藝發(fā)酵蝦青素的培養(yǎng)基，包含發(fā)酵清液及不含碳培養(yǎng)基，所述發(fā) 酵清液：將法夫酵母菌種按5%接種量接種于含葡萄糖30g/L、硫酸按5g/L、酵母膏3g/L、磷 酸二氫鉀2g/L、七水硫酸鎂lg/L、氯化鈣0. 2g/L的培養(yǎng)基中，21°C，pH 6. 0條件下培養(yǎng)7 天，發(fā)酵結束后，4000r/min離心30min，收集制得發(fā)酵清液，于-20°C儲存；所述不含碳培養(yǎng) 基：含有硫酸銨5g/L、酵母膏3g/L、磷酸二氫鉀2g/L、七水硫酸鎂lg/L、氯化鈣0. 2g/L的培 養(yǎng)基。
[0008] 作為實施例的優(yōu)選方式，在所述發(fā)酵清液中還補充有葡萄糖，至葡萄糖終濃度為 2〇g/L，并與所述不含碳培養(yǎng)基按體積比1:1混合。
[0009] 作為實施例的優(yōu)選方式，在所述發(fā)酵清液中還補充有葡萄糖，至葡萄糖終濃度為 3〇g/L，并與所述不含碳培養(yǎng)基按體積比1:1混合。
[0010] 一種清液回流工藝發(fā)酵蝦青素的方法，包括以下步驟：
[0011] 步驟一、制備法夫酵母菌種：
[0012] 用糖度計測定麥汁中的糖度，并用蒸餾水將其調至4° Bx，作為斜面菌種培養(yǎng)基 與種子培養(yǎng)基；
[0013] 將于斜面菌種培養(yǎng)基活化的菌種接種于裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于 22°C、190r/min的搖床中培養(yǎng)3d，得到1代搖瓶種子；取lmL 1代搖瓶種子轉接到新鮮的種 子培養(yǎng)基中，于相同的條件下培養(yǎng)48h，得到2代搖瓶種子；
[0014] 步驟三、配制不含碳培養(yǎng)基：
[0015] 不含碳培養(yǎng)基的組成為硫酸銨5g/L、酵母膏3g/L、磷酸二氫鉀2g/L、七水硫酸鎂 lg/L、氯化媽 〇? 2g/L，121°C滅菌 20min;
[0016] 步驟四、制備發(fā)酵清液：
[0017] 將法夫酵母菌種按5%接種量接種于含葡萄糖30g/L、硫酸按5g/L、酵母膏3g/L、 磷酸二氫鉀2g/L、七水硫酸鎂lg/L、氯化鈣0. 2g/L的5L培養(yǎng)基中，21°C，pH 6. 0條件下培 養(yǎng)7天，發(fā)酵結束后，4000r/min離心30min，收集制得發(fā)酵清液，于-20°C儲存；
[0018] 步驟五、清液回流發(fā)酵：
[0019] 搖瓶清液回流發(fā)酵：
[0020] 將發(fā)酵清液中的葡萄糖濃度補至20g/L，與不含碳培養(yǎng)基混合，121°C滅菌20min， 按5 %的接種量接種2代搖瓶種子法夫酵母于500mL搖瓶，22°C，190rpm振蕩培養(yǎng)5天，發(fā) 酵液離心制得富含蝦青素的法夫酵母菌體；
[0021] 7L發(fā)酵罐清液回流發(fā)酵：
[0022] 將發(fā)酵清液中的葡萄糖濃度補至30g/L，與不含碳培養(yǎng)基混合，121°C滅菌20min， 按5 %的接種量接種2代搖瓶種子法夫酵母于7L發(fā)酵罐中，21°C ;每8h估測殘余糖濃度， 若殘余糖濃度小于或等于l〇g/L，補加葡萄糖至終濃度20g/L ;采用pH計探頭在線全自動流 加25 %的氨水或lmol/L的硫酸溶液，控制pH恒定6. 0 ;通過調節(jié)攪拌轉速和通氣量控制整 個發(fā)酵過程溶氧多30%，通氣量控制在3L/min，攪拌轉速下限lOOr/min，攪拌轉速上限為 800r/min ;培養(yǎng)7天；發(fā)酵液離心，制得富含蝦青素的法夫酵母菌體。
[0023] 作為實施例的優(yōu)選方式，所述步驟五，在搖瓶清液回流發(fā)酵或7L發(fā)酵罐清液回流 發(fā)酵中，用蒸餾水稀釋發(fā)酵清液至一定倍數(shù)后取〇. 2mL，與0. 6mL DNS試劑混合，沸水浴反 應15min，冷卻后蒸餾水定容至5mL，在520nm處測吸光度，由標準曲線計算即可得到發(fā)酵清 液的殘余糖濃度，將葡萄糖濃度補至20g/L或30g/L，與不含碳培養(yǎng)基混合。
[0024] 作為實施例的優(yōu)選方式，所述步驟五，在搖瓶清液回流發(fā)酵或7L發(fā)酵罐清液回流 發(fā)酵中，發(fā)酵清液與不含碳培養(yǎng)基按體積比1:1混合。
[0025] 本發(fā)明采用上述技術方案后，采用發(fā)酵清液培養(yǎng)法夫酵母，在發(fā)酵結束后，比對照 在沒有添加發(fā)酵清液的培養(yǎng)條件下，提高了蝦青素的產量，并減少了廢液的排放，具有重要 的研宄價值和廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明的發(fā)酵清液與不含碳培養(yǎng)基按體積比1:1混合對搖瓶培養(yǎng)法夫酵母 蝦青素產量的影響。
[0027]圖2為本發(fā)明的發(fā)酵清液與不含碳培養(yǎng)基按體積比1:1混合對7L發(fā)酵罐培養(yǎng)法 夫酵母蝦青素產量的影響。
【具體實施方式】
[0028] 下列實施例中采用的檢測方法：
[0029] a.生物量的測定：
[0030]干重法：取5mL發(fā)酵液于離心管，4000r/min離心5min，并用蒸餾水洗絳菌體兩次， 于105 °C烘干至恒重。
[0031] b.總類胡蘿卜素含量的測定：
[0032] 采用二甲基亞砜（DMSO)法破壁：取2. 5mL發(fā)酵液，離心后沉淀用蒸餾水洗滌2次， 加入預熱至75°C的二甲基亞砜2mL，充分振蕩搖勾后，加入5mL乙醇振蕩均勾，4000r/min離 心5min取上清液，用乙醇定容至10mL。使用紫外可見分光光度計在474nm波長下進行檢 測。
[0033] c.蝦青素含量檢測
[0034]使用 Aglient 1200 高效液相色譜儀檢測，Nova-Pak C18 柱（3. 9X 150mm，4 y m)， 液相分析時控制流速lmL/min，柱溫30°C，柱壓0_3000psi，進樣量20 y L，檢測波長474nm。 梯度條件見表1 :
[0035] 表1液相分析梯度條件 [00361
【主權項】
1. 一種清液回流工藝發(fā)酵蝦青素的培養(yǎng)基，其特征在于：包含發(fā)酵清液及不含碳培養(yǎng) 基，所述發(fā)酵清液：將法夫酵母菌種按5%接種量接種于含葡萄糖30 g/L、硫酸銨5 g/L、酵 母膏3 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、七水硫酸鎂1 g/L、氯化鈣0.2 g/L的培養(yǎng)基中，21°C，pH 6.0條件下培養(yǎng)7天，發(fā)酵結束后，4 000 r/min離心30 min，收集制得發(fā)酵清液，于-20°C 儲存；所述不含碳培養(yǎng)基：含有硫酸銨5 g/L、酵母膏3 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、七水硫酸鎂 1 g/L、氯化鈣0.2 g/L的培養(yǎng)基。
2. 如權利要求1所述的一種清液回流工藝發(fā)酵蝦青素的培養(yǎng)基，其特征在于：在所述 發(fā)酵清液中還補充有葡萄糖，至葡萄糖終濃度為20 g/L，并與所述不含碳培養(yǎng)基按體積比 1:1混合。
3. 如權利要求1所述的一種清液回流工藝發(fā)酵蝦青素的培養(yǎng)基，其特征在于：在所述 發(fā)酵清液中還補充有葡萄糖，至葡萄糖終濃度為30 g/L，并與所述不含碳培養(yǎng)基按體積比 1:1混合。
4. 一種清液回流工藝發(fā)酵蝦青素的方法，其特征在于：包括以下步驟： 步驟一、制備法夫酵母菌種： 用糖度計測定麥汁中的糖度，并用蒸餾水將其調至4° Bx，作為斜面菌種培養(yǎng)基與種 子培養(yǎng)基； 將于斜面菌種培養(yǎng)基活化的菌種接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于22 °C、190 r/min的搖床中培養(yǎng)3 d，得到1代搖瓶種子；取1 mL 1代搖瓶種子轉接到新鮮的 種子培養(yǎng)基中，于相同的條件下培養(yǎng)48 h，得到2代搖瓶種子； 步驟三、配制不含碳培養(yǎng)基： 不含碳培養(yǎng)基的組成為硫酸銨5 g/L、酵母膏3 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、七水硫酸鎂1 g/L、氯化媽 〇? 2 g/L，121°C滅菌 20min ; 步驟四、制備發(fā)酵清液： 將法夫酵母菌種按5%接種量接種于含葡萄糖30 g/L、硫酸按5 g/L、酵母膏3 g/L、磷 酸二氫鉀2 g/L、七水硫酸鎂1 g/L、氯化鈣0.2 g/L的5 L培養(yǎng)基中，21°C，pH 6.0條件下 培養(yǎng)7天，發(fā)酵結束后，4 000 r/min離心30 min，收集制得發(fā)酵清液，于-20°C儲存； 步驟五、清液回流發(fā)酵： 搖瓶清液回流發(fā)酵： 將發(fā)酵清液中的葡萄糖濃度補至20 g/L，與不含碳培養(yǎng)基混合，121°C滅菌20 min，按 5%的接種量接種2代搖瓶種子法夫酵母于500 mL搖瓶，22°C，190 rpm振蕩培養(yǎng)5天，發(fā)酵 液離心制得富含蝦青素的法夫酵母菌體； 7 L發(fā)酵罐清液回流發(fā)酵： 將發(fā)酵清液中的葡萄糖濃度補至30 g/L，與不含碳培養(yǎng)基混合，121°C滅菌20 min，按 5%的接種量接種2代搖瓶種子法夫酵母于7 L發(fā)酵罐中，21°C;每8 h估測殘余糖濃度，若 殘余糖濃度小于或等于10 g/L，補加葡萄糖至終濃度20 g/L;采用pH計探頭在線全自動流 加25%的氨水或1 mol/L的硫酸溶液，控制pH恒定6. 0 ;通過調節(jié)攪拌轉速和通氣量控制 整個發(fā)酵過程溶氧彡30%，通氣量控制在3 L/min，攪拌轉速下限100 r/min，攪拌轉速上限 為800 r/min ;培養(yǎng)7天；發(fā)酵液離心，制得富含蝦青素的法夫酵母菌體。
5. 如權利要求4所述的一種清液回流工藝發(fā)酵蝦青素的方法，其特征在于：所述步驟 五，在搖瓶清液回流發(fā)酵或7 L發(fā)酵罐清液回流發(fā)酵中，用蒸餾水稀釋發(fā)酵清液至一定倍數(shù) 后取0. 2 mL，與0. 6 mL DNS試劑混合，沸水浴反應15 min，冷卻后蒸餾水定容至5 mL，在 520 nm處測吸光度，由標準曲線計算即可得到發(fā)酵清液的殘余糖濃度，將葡萄糖濃度補至 20g/L或30 g/L，與不含碳培養(yǎng)基混合。
6.如權利要求4所述的一種清液回流工藝發(fā)酵蝦青素的方法，其特征在于：所述步驟 五，在搖瓶清液回流發(fā)酵或7 L發(fā)酵罐清液回流發(fā)酵中，發(fā)酵清液與不含碳培養(yǎng)基按體積比 1:1混合。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種清液回流發(fā)酵蝦青素的培養(yǎng)基，包括發(fā)酵清液和不含碳培養(yǎng)基；本發(fā)明還公開了一種清液回流發(fā)酵蝦青素的方法，利用適宜濃度的上清液作為培養(yǎng)基培養(yǎng)法夫酵母發(fā)酵生產蝦青素，提高其對發(fā)酵液中營養(yǎng)成分的利用率，且在獲得產物的同時降低成本減少廢液，特別是降低了環(huán)境污染。本發(fā)明的有益效果為：具有易操作、低成本、益環(huán)保等優(yōu)點，并且實驗結果表明適宜濃度的上清液促進了蝦青素的產量，可為工業(yè)化生產蝦青素提供指導。與其他工藝比較，該工藝可以保證蝦青素的產量，又能降低環(huán)境污染，從而使其具有廣闊的應用前景。
【IPC分類】C12R1-645, C12P23-00
【公開號】CN104673871
【申請?zhí)枴緾N201510078206
【發(fā)明人】肖安風, 蔡慧農, 倪輝, 沈寧燕, 李利君, 楊秋明, 陳艷紅, 姜澤東, 黃高凌, 楊遠帆, 杜希萍
【申請人】集美大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月13日