用于基因快速檢測的細胞裂解液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于基因快速檢測的細胞裂解液。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReation，PCR)是體外酶促合成特異DNA片段 的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。自1985年穆勒發(fā)明聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR) 以來，生物科學(xué)家的研究方式逐漸被改變。這項能在短時間內(nèi)獲得大量DNA片段的技術(shù)，在 法醫(yī)學(xué)、DNA克隆、基因組分析、遺傳病和傳染病診斷中發(fā)揮著巨大作用。
[0003] PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。它不僅可以用 基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達調(diào)控的 研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。 例如：與許多疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)決定 了人類疾病的易感性和藥物反應(yīng)的差異性，對群體遺傳學(xué)、制藥業(yè)、法醫(yī)學(xué)、癌癥及遺傳性 疾病甚至進化的研究都將產(chǎn)生不可估量的影響。通過研究SNP圖譜，可以更深刻地認識癌 癥、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等發(fā)病率高的多基因疾病的發(fā)生機制。
[0004] PCR反應(yīng)體系中包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液、Mg2+、引物等，在反應(yīng)時加入 相應(yīng)的模板DNA即可。目前，進行PCR反應(yīng)都最常用的樣本是血液，血痕，帶毛囊的毛發(fā)，口 腔粘膜細胞等，其它如精斑，混合斑，肌肉，牙齒，骨骼，甚至胎兒的羊水等，但是樣本不能直 接用于PCR反應(yīng)，需要加入從樣本中提取純化的DNA作為模板。如果采用血液樣本，從采血 到提取純化DNA完成，至少需要4個小時、效率較低。現(xiàn)有的細胞裂解方法包括化學(xué)裂解、 酶裂解和機械裂解，化學(xué)裂解和酶裂解通常是比較溫和的方法，通常會很少使DNA斷裂，是 提取純化DNA中常用的方法。目前還沒一種細胞裂解方法直接應(yīng)用于PCR。因此，直接將細 胞作為模板加入PCR反應(yīng)混合液中進行反應(yīng)，則在PCR過程中細胞裂解不徹底，并且細胞裂 解之后的細胞碎片以及一些蛋白酶會對PCR反應(yīng)造成阻礙，導(dǎo)致基因擴增效率低或?qū)嶒炇?敗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種反應(yīng)快速、效率高的用于基因快速擴增或檢 測的細胞裂解液。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：用于基因快速檢測的細胞裂 解液，所述的細胞裂解液的原料由十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚組成。
[0007] 采用本發(fā)明技術(shù)方案的用于基因快速檢測的細胞裂解液，細胞裂解液的作用是 溶解細胞質(zhì)和細胞膜，破壞分子間許多微弱的化學(xué)鍵，分解一些蛋白酶，降低細胞裂解之后 產(chǎn)生的雜質(zhì)對PCR反應(yīng)的影響。所述的細胞裂解液的原料由十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛 基苯基醚組成。聚乙二醇辛基苯基醚是一種非離子型表面活性劑，十二烷基硫酸鈉是一種 能夠使蛋白質(zhì)變性的強陰離子去污劑。在細胞和分子生物學(xué)領(lǐng)域，十二烷基硫酸鈉，簡稱 SDS，經(jīng)常被用于核酸抽提操作中破壞細胞壁及裂解核酸與蛋白復(fù)合物，在較高溫度下，破 壞蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，使DNA釋放出來。聚乙二醇辛基苯基醚簡稱Triton X-100,被用 于分解蛋白酶，聚乙二醇辛基苯基醚在基因工程中還用作限制性內(nèi)切酶的緩沖液的成分之 一。為了解決細胞裂解在基因檢測過程中裂解不徹底，細胞碎片以及一些蛋白酶會對PCR 反應(yīng)造成阻礙，造成實驗失敗的問題，發(fā)明人在通過多次試驗，把細胞裂解液的成分以一定 的比例混合加在PCR反應(yīng)混合液中，實現(xiàn)了直接以口腔細胞為模板進行PCR反應(yīng)，從而可 在PCR反應(yīng)的過程中省略提純DNA的步驟，且避免污染樣品，從而節(jié)約時間，通過SDS和 Triton X-100混合組成，可以實現(xiàn)裂解細胞以及降低細胞破裂之后細胞碎片對PCR的影 響，簡化實驗步驟，檢測過程僅需要約lh。
[0008] 進一步，所述的細胞裂解液的原料終濃度為： 十二烷基硫酸鈉〇. 005-0. 015%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚 0.001-0. 03%w/v。
[0009] 進一步，所述的細胞裂解液的原料終濃度為： 十二烷基硫酸鈉〇. 〇〇5%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 01%w/v。
[0010] 進一步，所述的細胞裂解液的原料終濃度為： 十二烷基硫酸鈉0. 〇〇9%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 02%w/v。
[0011] 進一步，所述的細胞裂解液的原料終濃度為： 十二烷基硫酸鈉0. 〇〇5%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 001%w/v。
[0012] 進一步，所述的細胞裂解液的原料終濃度為： 十二烷基硫酸鈉0. 〇15%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 003%w/v。
【附圖說明】
[0013] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明技術(shù)方案進一步說明： 圖1是本發(fā)明實施例二的熒光檢測結(jié)果； 圖2是本發(fā)明實施例二的檢測結(jié)果一； 圖3是本發(fā)明實施例二的檢測結(jié)果二； 圖4是本發(fā)明實施例二的檢測結(jié)果三； 圖5是本發(fā)明實施例一的檢測結(jié)果一； 圖6是本發(fā)明實施例一的檢測結(jié)果二； 圖7是本發(fā)明實施例一的檢測結(jié)果三； 圖8是本發(fā)明實施例四的檢測結(jié)果一； 圖9是本發(fā)明實施例四的檢測結(jié)果二； 圖10是本發(fā)明實施例四的檢測結(jié)果三； 圖11是本發(fā)明實施例七的檢測結(jié)果一； 圖12是本發(fā)明實施例七的檢測結(jié)果二； 圖13是本發(fā)明實施例七的檢測結(jié)果三； 圖14是本發(fā)明實施例八的檢測結(jié)果； 圖15是本發(fā)明實施例九的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0014] 本發(fā)明用于基因快速檢測的細胞裂解液可應(yīng)用于基因擴增和基因快速檢測。比如 CYP2C19*2基因型快速檢測、ABCB1基因型快速檢測、牛線粒體基因的PCR擴增、玉米甘油 醛-3-磷酸脫氫酶基因的PCR擴增中 ： 一、用CYP2C19*2基因型快速檢測和ABCB1基因型快速檢測分別說明本發(fā)明。
[0015] 按照23ul的反應(yīng)體系配制50支試劑，以下所指的終濃度是指各組分在23ul體系 中的濃度，ul/支是指各個組分在試劑管中的含量。
[0016] 以下實驗操作均在生物安全柜中進行，保證無污染。
[0017] 實施例一至實施例六為CYP2C19*2基因型的檢測。
[0018] CYP2C19是CYP450酶第二亞家族中的重要成員，在肝臟中大量表達，參與多種藥 物的代謝。由于CYP2C19基因具有單核苷酸多態(tài)性，因此CYP2C19酶活性存在顯著的個體 差異和種族差異。其最常見的兩種突變是CYP2C19*2和CYP2C19*3,它們都屬與非同義突 變，所以能直接影響該酶對藥物的代謝能力。CYP2C19*2 (681G>A，rs244285)變異，導(dǎo)致翻 譯過程中產(chǎn)生一個異常的剪接位點從而產(chǎn)生一個截短的無功能的蛋白質(zhì)。在藥物代謝過程 中，該突變會使一些藥物的血藥濃度升高，如抗凝血藥物氯吡格雷、抗抗癲癇藥物苯妥英鈉 等，使患者出現(xiàn)不良的藥物反應(yīng)。
[0019] CYP2C19*2突變基因型有純合子A/A和雜合子G/A兩種，其野生型基因型為G/G。 純合子A/A患者對藥物的代謝類型屬于慢代謝型，雜合子G/A患者對藥物的代謝類型屬于 中等代謝型，而野生型G/G患者對藥物的代謝屬于正常代謝型。通過確定患者的基因型，就 可以判定患者的藥物代謝類型，從而幫助醫(yī)生正確選擇合適的藥物并合理調(diào)整藥物劑量， 提高藥物使用有效性，降低毒副作用。
[0020](一)、細胞裂解液的配制：配置1000U1的細胞裂解液試劑，試劑原料及其終濃度如 表1所示，十二烷基硫酸鈉（SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100)購自上海普洛麥 格生物制品有限公司，初始濃度分別為0. lg/ml、l. 0655g/ml。
[0021] 表 1
【主權(quán)項】
1. 用于基因快速檢測的細胞裂解液，其特征在于：所述的細胞裂解液的原料由十二烷 基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚組成。
2. 如權(quán)利要求1所述用于基因快速檢測的細胞裂解液，其特征在于：所述的細胞裂解 液的原料終濃度為： 十二烷基硫酸鈉〇. 005-0. 015%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚 0.001-0. 03%w/v。
3. 如權(quán)利要求2所述用于基因快速檢測的細胞裂解液，其特征在于：所述的細胞裂解 液的原料終濃度為： 十二烷基硫酸鈉〇. 〇〇5%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 01%w/v。
4. 如權(quán)利要求2所述用于基因快速檢測的細胞裂解液，其特征在于：所述的細胞裂解 液的原料終濃度為： 十二烷基硫酸鈉〇. 〇〇9%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 02%w/v。
5. 如權(quán)利要求2所述用于基因快速檢測的細胞裂解液，其特征在于：所述的細胞裂解 液的原料終濃度為： 十二烷基硫酸鈉〇. 〇〇5%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 001%w/v。
6. 如權(quán)利要求2所述用于基因快速檢測的細胞裂解液，其特征在于：所述的細胞裂解 液的原料終濃度為： 十二烷基硫酸鈉〇. 〇15%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 003%w/v。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于基因快速檢測的細胞裂解液，包括PCR反應(yīng)混合液，PCR反應(yīng)混合液原料包括DNA聚合酶、dNTPs、上游引物、下游引物、突變型分子信標(biāo)、野生型分子信標(biāo)、MgCl2、PCR緩沖液和細胞裂解液。本發(fā)明提供一種與PCR反應(yīng)混合液配合可以實現(xiàn)以細胞為模板進行基因擴增或檢測的細胞裂解液及其應(yīng)用方法。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104673914
【申請?zhí)枴緾N201510078877
【發(fā)明人】任曉東, 羅志超
【申請人】重慶京因生物科技有限責(zé)任公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月13日