調(diào)控玉米百粒重主效qtl的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與玉米百粒重主效QTL連鎖的SSR分子標(biāo)記及在玉米百粒重主效 QTL分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為糧食、飼料和工業(yè)原料作物，玉米在世界農(nóng)業(yè)中占有重要的角色。人們對玉米 的需求預(yù)計將在2020年超過對小麥和水稻的需求（Ping PL&Pandey S2001)。然而，在大多 數(shù)發(fā)展中國家，玉米的單位面積產(chǎn)量仍然很低。研宄玉米產(chǎn)量性狀的遺傳控制機制，對于進 一步提高玉米單產(chǎn)具有重要意義。
[0003] 早期遺傳群體多為&不:3、8(：1、011和1^等初級群體，只能對作物性狀進行〇11分 析，且微效的QTL -般檢測不出來，其遺傳背景較復(fù)雜，影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，不利于主 效QTL精細定位和克隆等進一步的研宄。隨著研宄的逐漸深入，IL、BCRIL、NIL、CSSL等次 級作圖群體得到了廣泛的應(yīng)用。理想的代換系是指在輪回親本的遺傳背景上只含有單個供 體染色體片段，即染色體單片段代換系（Single Segment Substitution Line, SSSLhSSSL 可打破優(yōu)良基因和不量基因間的連鎖，有效檢測出供體親本的有利基因。每個SSSL純合體 與輪回親本在基因組上僅有一個染色體片段的差異，其表型在產(chǎn)量性狀上的任何顯著的差 異均與這唯一的代換片段有關(guān)。
[0004] 分子標(biāo)記是DNA水平上的遺傳差異的直接反映。第一代是以分子雜交為基礎(chǔ)的標(biāo) 記技術(shù)，主要是限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)，利用限制性內(nèi)切酶能識別DNA分子的特異 序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展， 產(chǎn)生了第二代以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，如簡單序列重復(fù)標(biāo)記（SSR)技術(shù)、隨機擴增多 態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD)、表達序列標(biāo)簽（EST)技術(shù)、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP)等。第三代 分子標(biāo)記主要是單核苷酸多態(tài)（SNP)，指單個核苷酸變異而引起的DNA序列多態(tài)性。利用分 子標(biāo)記技術(shù)進行基因定位研宄時，工作者要根據(jù)自己要解決的問題和研宄的作物的遺傳背 景選擇理想的分子標(biāo)記。
[0005] 鄭58和昌7-2是中國的骨干玉米自交系，已經(jīng)完成基因組測序，有大量的SNP、IDP 標(biāo)記和保守序列可用于SSSL群體功能性鑒定以及主效QTL的精確定位和克隆。
[0006] 作物的性狀分為數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀，質(zhì)量性狀是由單基因控制的，而由多基因 進行控制的稱數(shù)量性狀基因座位（QTL)。運用于定位的作圖群體主要是初級作圖群體、次 級作圖群體和高級作圖群體，次級群體的遺傳背景很相似，消除大部分的遺傳背景干擾，多 用于QTL的精細定位。單片段代換系是在受體遺傳背景上只含有一個供體染色體片段的材 料，消除了遺傳背景的干擾，適用于復(fù)雜性狀的基因初步定位、精細定位、基因克隆和遺傳 機制等研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本課題組以玉米骨干自交系鄭58為受體，昌7-2為供體，通過回交和SSR分子標(biāo) 記輔助選擇構(gòu)建鄭58遺傳背景上昌7-2的單片段代換系，共獲得108份純合的單片段代換 系，其中有46個不重復(fù)的代換片段。以其中的一份單片段代換系SSSL-Z22 (代換片段為 bnlg278…umcl680…bnlgl306)作為基礎(chǔ)材料，通過構(gòu)建SSSL-Z22和鄭58的F2:3群體，使 用SSR分子標(biāo)記和作圖軟件winQTLcart2. 5等方法對玉米的百粒重及相關(guān)性狀進行了基因 定位。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種調(diào)控玉米百粒重主效QTL的分子標(biāo)記，其特征在于：以 玉米總DNA為模板，對SSR引物Sym035和Syml 19進行PCR擴增，經(jīng)凝膠電泳得到長度分別 為165bp和147bp的DNA片段，在第五染色體上Bin5. 06區(qū)段位于SSR分子標(biāo)記Sym035與 Symll9之間存在一個調(diào)控玉米百粒重大小的QTL ;
[0009] 所述SSR標(biāo)記Sym035的序列為：
[0010] F：5 ' -TAAGGAGCAACAATGGCGGA-3 '
[0011] R ：5 ' -CATCCGCAGCAAATACCACG-3 '；
[0012] 所述SSR標(biāo)記Syml 19的序列為：
[0013] F：5 ' -ATCAGCGTCGTCGGCATTA-3 '
[0014] R:5 ' -TGGGACCTCGGACTACACTAT-3 '。
[0015] 如權(quán)利要求1所述的調(diào)控玉米百粒重主效QTL的分子標(biāo)記在控制玉米籽粒大小中 的應(yīng)用。
[0016] 如權(quán)利要求1所述的調(diào)控玉米百粒重主效QTL的分子標(biāo)記在控制玉米產(chǎn)量中的應(yīng) 用。
[0017] 以含有301個SSSL-Z22X鄭58的F2:3家系為材料，在玉米第5號染色體Bin5. 06 區(qū)域內(nèi)開發(fā)標(biāo)記，使用34對SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了目標(biāo)染色體區(qū)段內(nèi)的高密度遺傳圖譜，區(qū) 段內(nèi)遺傳距離總長為25. 9cM。利用winQTLcart2. 5軟件中的復(fù)合區(qū)間作圖法，將qhkw5-3 定位在SSR分子標(biāo)記Sym035與Syml 19之間，其遺傳區(qū)間為9. 7cM。
[0018] 利用同樣的F2:3群體，對粒長、粒寬和粒厚的QTL分析表明，在分子標(biāo)記Sym024和 Syml28之間定位一個粒寬的QTL，遺傳距離為13. lcM。分離群體內(nèi)百粒重與粒長、粒寬和粒 厚的相關(guān)系數(shù)分別是〇. 532、0. 726、0. 187。單片段代換系SSSL-Z22百粒重的減少主要由粒 寬的變窄引起的。
【附圖說明】
[0019] 圖1 SSSL-Z22的片段，白色部分為鄭58遺傳背景，黑色部分為昌7-2染色體片 段；
[0020] 圖2分離群體內(nèi)單株百粒重的次數(shù)分布；
[0021] 圖3分子標(biāo)記間的遺傳距離；
[0022] 圖4百粒重QTL定位圖；
[0023] 圖5 34對SSR標(biāo)記的連鎖圖譜；
[0024] 圖6百粒重QTL定位圖；
[0025] 圖7百粒重QTL的定位圖，柱形黑色部分為定位到的百粒重QTL區(qū)間；
[0026] 圖8粒長（A)、粒寬⑶和粒厚（C)表型次數(shù)分布圖；
[0027]圖9百粒重與粒長（A)、粒寬⑶和粒厚（C)的相關(guān)散點圖；
[0028] 圖10粒寬QTL定位圖。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于 例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。
[0030] 1.SSR引物設(shè)計
[0031] 按照引物設(shè)計原則，利用軟件Primer 6.0得到引物序列，再將序列送至公司進行 合成。
[0032] 2.采用SDS法提取葉片DNA
[0033] (1)于玉米3展葉時，在每區(qū)取長勢一致的葉片5片，放置-80°C冰箱內(nèi)保存。
[0034] (2)將每區(qū)的5片鮮葉整齊疊放，均勻取下約5g鮮葉放入盛有液氮的研缽中迅速 磨成粉末，倒入2. OmL的Beckman離心管中；
[0035] (3)加入600 y L預(yù)熱到65°C的SDS提取液；
[0036] (4)再加入20yL從-20°C中取出的巰基乙醇（1%體積比）混勾，輕緩攪拌
[0037] (5) 65°C水浴30~60min，其間搖動3~5次，至底層溶液變黑；
[0038] (6)取出，冷卻至室溫，加200 y L KAC，冰水浴lOmin ;
[0039] (7)取出，加600 yL的氯仿：異戊醇（24:1)，充分混合，輕搖30~60min至底部呈 墨綠色，室溫靜置lOmin;
[0040] (8) 12000r/min，離心 lOmin (注意平衡）；
[0041] (9)取上清液于1. 5mL離心管中，加入（預(yù)冷-20°C )無水乙醇800 y L，置于4°C 冰箱中，DNA緩慢析出；
[0042] (10) 12000rpm，離心3min ;倒掉上清液，口朝下于紙巾上風(fēng)干；
[0043] (11)加入 50yL TE，4°C保存。
[0044] 3. SDS法提取DNA所需溶液及其配置方法
[0045] 所需溶液：SDS 提取液，1M Tris ? HC1 (PH8. 0)，5M NaCl，0. 5M EDTA(PH8. 0)， SDS(10 % )，1M HCL(lmol/L)，10 倍的 TE，5M KAC，10M NaOH，3M NaAc(PH5.2)，0.1M 1^8.此1(?118.0)，1￡儲藏液，10倍的18￡，1]\1順，(：溶液，含1〇1111順，(：的76%酒精溶液。 各溶液的配置方法如下：
[0046] 表1 SDS提取液配置方法
[0047]
【主權(quán)項】
1. 一種調(diào)控玉米百粒重主效QTL的分子標(biāo)記，其特征在于：以玉米總DNA為模板，對 SSR引物Sym035和Symll9進行PCR擴增，經(jīng)凝膠電泳得到長度分別為165bp和147bp的 DNA片段，在第五染色體上Bin5. 06區(qū)段位于SSR分子標(biāo)記Sym035與Syml 19之間存在一個 調(diào)控玉米百粒重大小的QTL; 所述SSR標(biāo)記Sym035的序列為： F ：5 ' -TAAGGAGCAACAATGGCGGA-3 ' R ：5 ' -CATCCGCAGCAAATACCACG-3 '； 所述SSR標(biāo)記Syml 19的序列為： F ：5 ' -ATCAGCGTCGTCGGCATTA-3 ' R :5 ^ -TGGGACCTCGGACTACACTAT-3 ^。
2. 如權(quán)利要求1所述的調(diào)控玉米百粒重主效QTL的分子標(biāo)記在控制玉米籽粒大小中的 應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的調(diào)控玉米百粒重主效QTL的分子標(biāo)記在控制玉米產(chǎn)量中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種調(diào)控玉米百粒重的主效QTL的分子標(biāo)記，以玉米總DNA為模板，對SSR引物Sym035和Sym119進行PCR擴增，經(jīng)凝膠電泳得到長度分別為165bp和147bp的DNA片段，在第五染色體上Bin5.06區(qū)段位于SSR分子標(biāo)記Sym035與Sym119之間存在一個調(diào)控玉米百粒重大小的QTL。利用同樣的F2:3群體，對粒長、粒寬和粒厚的QTL分析表明，在分子標(biāo)記Sym024和Sym128之間定位一個粒寬的QTL，遺傳距離為13.1cM。分離群體內(nèi)百粒重與粒長、粒寬和粒厚的相關(guān)系數(shù)分別是0.532、0.726、0.187。單片段代換系SSSL-Z22百粒重的減少主要由粒寬的變窄引起的。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104673924
【申請?zhí)枴緾N201510118725
【發(fā)明人】席章營, 馮園園, 王順友, 白青河, 夏雪, 陳春俠, 陸明洋
【申請人】河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月18日