一種高分辨率ssr分子標記基因分型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及一種基于測序儀的SSR分子標記基因分型的高 分辨率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物基因組序列中存在一種由幾個堿基為重復單位并經(jīng)過串聯(lián)排列組成的DNA 序列，英文簡稱為 SSR(simple sequence repeats)，也稱為微衛(wèi)星（microsatellite) (Ellegren 2004 ;Sharma2007)。SSR序列的特點是在品種間存在可以遺傳的多態(tài)性，是本 世紀以來發(fā)現(xiàn)的可以聯(lián)系基因組序列和性狀品質(zhì)基因及分子育種最重要的紐帶（Sharma 2007 ;Xu and Crouch 2008)。SSR序列是用來開發(fā)分子標記最理想的序列之一，廣泛用于 研究物體品種的遺傳與進化關(guān)系、反向遺傳中基因的圖位克隆、性狀的QTL定位和分子育 種（Schlotterer 2004)。最早的SSR分子標記主要是從EST或者零散的DNA序列中開發(fā)。 自從擬南芥和水稻基因組被測定以來，大量SSR分子標記被開發(fā)，用來定位基因，品質(zhì)改良 和育種（Arabidopsis Genome Initiative 2000 ;International Rice Genome Sequencing Project 2005 ;Xu and Crouch 2008)。至今SSR標記是兩大廣泛應(yīng)用的主要分子標記之一 (Davey et al. 2011)。據(jù)文獻查證，至今還沒有報道系統(tǒng)的成套SSR分子標記開發(fā)和檢測 方法。SSR分子標記的開發(fā)報道倒是有一些。這些報道一般只適合小量的SSR標記的PCR 引物設(shè)計，因為設(shè)計PCR引物的技術(shù)參數(shù)比較寬松，在應(yīng)用時PCR引物往往反復需要優(yōu)化每 一對PCR引物的反應(yīng)條件；檢測往往是通過凝膠電泳的方法，從而分辨率低，勞動力大，效 率低（Tong et al.2012)。Bindler等采用熒光標記和測序儀檢測的辦法檢測SSR片段，大 大提高了檢測效率（Bindler et al. 2011 ;Bindler et al. 2007);但是每一個SSR標記均 需要熒光來單獨標記其中的一個引物，從而增大了成本。針對現(xiàn)有方法的不足，我們開發(fā)了 一套系統(tǒng)的成套SSR分子標記開發(fā)和檢測方法。對于任何一個SSR分子標記，我們的方法 均只要在PCR反應(yīng)時加入一個通用的共同的熒光標記引物，在PCR引物設(shè)計時用軟件檢測 了通用熒光引物與其他兩個PCR引物的兼容性，從而保證了通用引物的可靠性；又由于后 續(xù)PCR反應(yīng)是基于共同的熒光標記引物，因此不同的分子標記的PCR條件是統(tǒng)一的。熒光 引物合成價格比常規(guī)的引物合成要高出幾倍到幾十倍，因此我們的發(fā)明方法中采用通用的 共同的突光標記引物的策略，大大降低了實驗成本和效率?，F(xiàn)有一些報道一次只檢測一種 熒光標記的產(chǎn)物，我們的本發(fā)明方法可以采取多重（1-3重）熒光產(chǎn)物混合檢測，從而進一 步提_ 了檢測效率。
[0003] 本發(fā)明的方法在反復摸索的情況下，采用全功能的Taq聚合酶，進一步保證了 PCR 產(chǎn)物長度的一致性，從而雜信號低，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的基因分型的峰值不完美，峰型往往 有2 - 3個裂峰，跨越2 - 3bp的距離，從而大大降低了分辨率的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種高分辨率SSR分子標記基因分型的方法。該方法能克 服現(xiàn)有技術(shù)存在的基因分型的峰值不完美，峰型往往有2 - 3個裂峰，跨越2 - 3bp的距離， 從而大大降低了分辨率的不足。利用本發(fā)明的方法可以達到清晰的lbp的分辨率，片段的 峰型完美，沒有裂峰。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0006] -種_分辨率的SSR分子標記基因分型的方法，包括設(shè)計SSR分子標記的三引物， 配制SSR分子標記專用的PCR配方，進行SSR分子標記專用的PCR反應(yīng)，SSR分子標記的PCR 產(chǎn)物的分析，基因分型的數(shù)據(jù)分析步驟。
[0007] 如所述的一種高分辨率的SSR分子標記基因分型的方法，其中：
[0008] 所述的設(shè)計SSR分子標記的三引物為通用熒光標記引物，帶尾正向引物和反向引 物，原始儲備液濃度均為5uM，在PCR反應(yīng)中的用量體積的比為2 : 1 : 4;所述通用熒光標 記引物為公共引物，在引物合成時在5'末端加熒光標記，選擇熒光標記物為ABI測序儀能 識別的熒光試劑FAM或HEX或TAMRA，其中，熒光的選擇不能與ABI測序儀基因分型所用的 DNA分子參照的熒光相同；正向引物和反向引物為帶有SSR序列位點的靶序列的特異引物， 使用引物設(shè)計軟件Primer3設(shè)計，在線使用網(wǎng)址為http://frodo. wi. mit. edu/primer3/， 設(shè)計時引物序列不能在SSR序列中，PCR產(chǎn)物包含SSR位點，長度為19 - 24bp，最適Tm為 60°C，GC%值在45 - 55%，無引物的二聚體結(jié)構(gòu)；帶尾正向引物為正向引物的序列的5'端 加上與熒光標記引物相同的序列CGTTGTAAAACGACGGCCAGT，不加熒光標記物，然后使用軟件 OligoAnalyzer 3. l(http://www. idtdna. com/)檢測，若無引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，該 帶尾正向引物序列合理，設(shè)計完成；如果有引物二聚體產(chǎn)生，則要用Primer3重新設(shè)計新的 正向引物和熒光標記引物相同的序列以后再用軟件檢測，直至無引物二聚體產(chǎn)生。
[0009] 如所述的一種高分辨率的SSR分子標記基因分型的方法，其中所述的配制SSR分 子標記專用的PCR配方是Taq聚合酶是全功能的DNA聚合酶，是用100ul或者更小的潔凈 PCR試管，PCR反應(yīng)總體積為15ul，按表1的配方依次加入設(shè)計的3種引物、待測樣品的DNA 和去離子水，熒光引物最后加入，混合試劑，輕微漩渦混合，并離心5秒鐘。這里的全功能 的 DNA 聚合酶配方采用 PhusiorT Hot Start Flex 2X Master Mix,但不限制于 phusion* Hot Start Flex 2X Master Mix,
[0010] 表1每15U1PCR反應(yīng)的試劑配方
[0011]
【主權(quán)項】
1. 一種商分辨率的SSR分子標記基因分型的方法，其特征在于：該方法包括設(shè)計SSR 分子標記的三引物，配制SSR分子標記專用的PCR配方，進行SSR分子標記專用的PCR反應(yīng)， SSR分子標記的PCR產(chǎn)物的分析，基因分型的數(shù)據(jù)分析步驟。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種高分辨率的SSR分子標記基因分型的方法，其特征在于： 所述的設(shè)計SSR分子標記的三引物為通用熒光標記引物，帶尾正向引物和反向引物， 原始儲備液濃度均為5uM，在PCR反應(yīng)中的用量體積的比為2 : 1 : 4;所述通用熒光標記 引物為公共引物，在引物合成時在5'末端加熒光標記，選擇熒光標記物為ABI測序儀能識 別的熒光試劑FAM或HEX或TAMRA，其中，熒光的選擇不能與ABI測序儀基因分型所用的 DNA分子參照的熒光相同；正向引物和反向引物為帶有SSR序列位點的靶序列的特異引物， 使用引物設(shè)計軟件Primer3設(shè)計，在線使用網(wǎng)址為http://frodo. wi. mit. edu/primer3/， 設(shè)計時引物序列不能在SSR序列中，PCR產(chǎn)物包含SSR位點，長度為19 - 24bp，最適Tm為 60°C，GC%值在45 - 55%，無引物的二聚體結(jié)構(gòu)；帶尾正向引物為正向引物的序列的5'端 加上與熒光標記引物相同的序列CGTTGTAAAACGACGGCCAGT，不加熒光標記物，然后使用軟件 OligoAnalyzer 3. l(http://www. idtdna. com/)檢測，若無引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，該 帶尾正向引物序列合理，設(shè)計完成；如果有引物二聚體產(chǎn)生，則要用Primer3重新設(shè)計新的 正向引物和熒光標記引物相同的序列以后再用軟件檢測，直至無引物二聚體產(chǎn)生。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種高分辨率的SSR分子標記基因分型的方法，其特征在于： 所述的配制SSR分子標記專用的PCR配方中的Taq聚合酶是全功能的DNA聚合酶，是用 IOOul或者更小的潔凈PCR試管，PCR反應(yīng)總體積為15ul，按表1的配方依次加入設(shè)計的3 種引物、待測樣品的DNA和去離子水，熒光引物最后加入，混合試劑，輕微漩渦混合，并離心 5秒鐘。這里的全功能的DNA聚合酶配方采用PhusiorT Hot Start Flex 2X Master Mix,但 不限制于 PhusiorV Hot Start Flex 2X Master Mix， 表1每15ulPCR反應(yīng)的試劑配方

4. 如權(quán)利要求1所述的一種高分辨率的SSR分子標記基因分型的方法，其特征在于： 所述的SSR分子標記專用的PCR反應(yīng)是將步驟3混好液體的試管置于帶有Touchdown功能 的PCR儀器進行擴增反應(yīng)，PCR反應(yīng)由3個touchdown循環(huán)和后續(xù)的35個標準循環(huán)組成， PCR循環(huán)的設(shè)置為起始變性溫度為94°C 3分鐘，3個touchdown循環(huán)為94°C變性30秒， 68°C退火1分鐘，每執(zhí)行一個循環(huán)后將退火溫度降低2°C，72°C延伸1分鐘，35個標準循環(huán) 為94°C變性30秒，58 °C退火45秒，72 °C延伸45秒，完成以上循環(huán)以后，在72 °C保持10分 鐘，最后將PCR產(chǎn)物冷卻到室溫或者4°C，從PCR儀取出以后，立即包裹錫箔紙避光，冷凍保 存或者繼續(xù)實驗。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種高分辨率的SSR分子標記基因分型的方法，其特征在于： 所述的SSR分子標記的PCR產(chǎn)物的分析分為瓊脂糖凝膠電泳和測序儀基因分型，其中瓊脂 糖凝膠電泳步驟非必須；所述瓊脂糖凝膠電泳是移取IOul的PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電 泳，按照常規(guī)方法電泳分離，EB染色，紫外成像儀觀察PCR擴增的DNA片段；移取I - 5ul的 PCR產(chǎn)物，用ABI3730XL按照儀器標準的基因分型法檢測，DNA分子大小的內(nèi)部參照標準采 用LIZ500,檢測前，不同熒光標記的PCR產(chǎn)物可以多重混合，混合至同一個PCR管進行檢測， 但是最多混合三種熒光標記的產(chǎn)物。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種高分辨率的SSR分子標記基因分型的方法，其特征在于： 所述的基因分型的數(shù)據(jù)分析采用的數(shù)據(jù)文件為.fsa格式，每一個PCR孔的樣品產(chǎn)生一個對 應(yīng)的數(shù)據(jù)文件.fsa ;將數(shù)據(jù)導入數(shù)據(jù)文件分析軟件如GeneMapper或者GeneMarker,然后按 照軟件的說明進行基因分型的數(shù)據(jù)分析；ABI測序儀的基因分型檢測時，標準DNA分子參照 的范圍包涵50 - 500bp ;1 - 5ul PCR產(chǎn)物的用量用于ABI測序儀的基因分型檢測，剩余PCR 產(chǎn)物能用于3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
【專利摘要】一種高分辨率SSR分子標記基因分型的方法。該方法使用3個引物在同一反應(yīng)體系中同時進行PCR擴增。提供了三個引物的設(shè)計的方法，相應(yīng)的PCR配方，PCR循環(huán)的參數(shù)和基于測序儀的片段分型的檢測方法。該方法提供了一種分辨率在一個核苷酸水平的基因分型用的引物設(shè)計方法、統(tǒng)一了PCR試劑的特定配方和PCR循環(huán)的參數(shù)，實驗過程無需優(yōu)化。此外解決了基于測序儀的SSR分子標記基因分型噪音大的問題。該方法適用各種物種DNA的SSR標記開發(fā)和高通量高分辨率的DNA片段分型。以煙草SSR分子標記為例測試了該方法應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104673929
【申請?zhí)枴緾N201510133012
【發(fā)明人】王學文
【申請人】中國科學院昆明植物研究所
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月25日