一種洗脫介孔硅材料表面吸附的多肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽洗脫方法，具體地說，是一種將吸附在介孔硅材料表面的多肽與介孔硅材料分離的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血漿中的內(nèi)源性肽大多是生物體內(nèi)組織或細(xì)胞微環(huán)境中的酶解反應(yīng)產(chǎn)物，反映了機(jī)體的生理和病理狀態(tài)，是一類潛在的疾病標(biāo)志物，在疾病診斷和臨床治療等方向具有重要的意義。然而絕大部分的內(nèi)源性肽在血漿中的含量極低，如白細(xì)胞介素6的濃度為05pg/mL (Mol.Cell Proteomics, 2002，1，845),遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了目前質(zhì)譜的檢測(cè)能力。此外,血衆(zhòng)中高含量的大蛋白(如血清白蛋白，濃度為35-50mg/mL)和鹽會(huì)對(duì)液相分離系統(tǒng)產(chǎn)生損害，對(duì)低含量多肽的直接質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。因此，對(duì)血漿樣品進(jìn)行前處理是必要的步驟，此過程必須同時(shí)具備富集低分子量多肽和排除蛋白及鹽的能力。
[0003]介孔材料孔徑分布在2_50nm，具有比表面積大、孔徑均一可調(diào)節(jié)、多樣的孔形貌等獨(dú)特的性質(zhì)，自出現(xiàn)以來就受到廣泛關(guān)注。將介孔材料應(yīng)用于多肽萃取時(shí)，其均一的孔結(jié)構(gòu)可以將蛋白排除在孔外，而通過疏水、靜電或親和等作用將多肽保留在孔內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)低含量肽的富集。Tian等首次將介孔材料MCM-41用于血漿中內(nèi)源性肽的選擇性萃取，認(rèn)為MCM-41對(duì)多肽的吸附是基于硅氧橋鍵與多肽之間的疏水作用(Angew.Chem.，2007，119，980)。后來該組相關(guān)工作通過將血漿的PH值調(diào)節(jié)到2.5，來抑制表面硅羥基的解離，從而增強(qiáng)材料與多肽之間的疏水作用(J.Sep.Sc1.，2007，30，2204)。在上述兩種萃取條件下，均依次用IMNaCl溶液和50%ACN來洗脫吸附在材料表面的多肽。實(shí)踐表明，這兩種洗脫液對(duì)多肽的洗脫效果都很差。因此發(fā)展一種簡(jiǎn)單、高效的多肽洗脫方法，對(duì)提高多肽的回收率及檢測(cè)靈敏度十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決現(xiàn)有技術(shù)中多肽洗脫效果差的問題，本發(fā)明提供一種洗脫介孔硅材料表面吸附的多肽的方法，以有機(jī)溶劑與鹽溶液的混合溶液對(duì)吸附在介孔硅材料上的多肽進(jìn)行洗脫。方法簡(jiǎn)單可靠，有效解決了介孔硅材料萃取多肽時(shí)回收率低的問題。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0006]一種洗脫介孔硅材料表面吸附的多肽的方法，其特征在于:以有機(jī)溶劑與鹽溶液的混合溶液對(duì)吸附在介孔硅材料上的多肽進(jìn)行洗脫，其中，鹽溶液的PH值大于7，且不低于堿性最強(qiáng)多肽的等電點(diǎn)2個(gè)pH單位。
[0007]所述鹽溶液的濃度為0.05-1M，其中，陽離子為Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、NH4+和N(CH3)4+ 中的一種或兩種以上，陰離子為 0H_、F_、CUr_、N03_、S042_、P043_、HC03_ 和 CH3C00_ 中的一種或兩種以上。
[0008]所述有機(jī)溶劑能與所述鹽溶液混溶，優(yōu)選碳數(shù)1-5的一元或二元醇、丙酮、丁酮、乙腈、丙腈、乙酸甲酯和乙酸乙酯中的一種或兩種以上。
[0009]所述一元或二元醇為甲醇、乙醇、異丙醇、丁二醇。
[0010]所述有機(jī)溶劑與鹽溶液的體積比為1:50-10:1。
[0011]所述多肽的分子量不聞?dòng)趌OKDa。
[0012]所述介孔硅材料為納米、微米顆粒或薄膜。
[0013]現(xiàn)有技術(shù)中采用50%ACN和NaCl溶液依次洗脫時(shí)，分別削弱了多肽與介孔硅材料之間的疏水或靜電相互作用。實(shí)踐表明，多肽分子與介孔硅材料表面同時(shí)存在上述兩種相互作用，本技術(shù)方案以有機(jī)溶劑與堿性鹽溶液的混合液為洗脫液，可同時(shí)削弱兩種相互作用，對(duì)吸附在介孔硅材料表面的多肽具有很強(qiáng)的洗脫能力。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)方案的主要區(qū)別在于:
[0014]I)現(xiàn)有技術(shù)(Angew.Chem.，2007，119，980 ；J.Sep.Sc1.，2007，30，2204)采用有機(jī)溶劑和NaCl溶液交替洗脫的方法，操作步驟多，且洗脫效果差；而本發(fā)明以有機(jī)溶劑和堿性鹽溶液的混合液一步洗脫，大大縮短了處理時(shí)間，節(jié)省了成本，提高了效率，并且洗脫過程中有機(jī)溶劑與堿性鹽溶液協(xié)同作用，更有利于多肽的洗脫，顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的洗脫效果O
[0015]2)現(xiàn)有技術(shù)中采用的鹽溶液為中性NaCl溶液，而本發(fā)明中的鹽溶液為堿性鹽溶液，其可改變介孔硅材料表面與多肽分子的帶電狀態(tài)，更有利于削弱靜電相互作用，大大提高了洗脫效率。
[0016]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0017]1、通過以有機(jī)溶劑與堿性鹽溶液的混合液為洗脫液，有效改善了對(duì)吸附在介孔硅材料表面多肽的洗脫效果，提高了多肽的回收率，有利于提高檢測(cè)靈敏度。
[0018]2、一次洗脫即可獲得好的洗脫效果，避免了多次交替洗脫時(shí)操作繁瑣、耗時(shí)等問題，節(jié)省了成本，提高了效率。
[0019]3、適用范圍寬，對(duì)分子量不高于1KDa的多肽均有很好的洗脫效果。4、所采用的洗脫液中鹽濃度較低，無需除鹽處理即可進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，兼容性好。
[0020]5、對(duì)生物樣品中的內(nèi)源性多肽進(jìn)行萃取時(shí)，由于洗脫效果好，能夠大大增加鑒定到的多肽數(shù)目，非常有利于疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及多肽組學(xué)的研究。
【附圖說明】
[0021]圖1介孔硅材料MCM-41對(duì)pH=3的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品萃取后，采用不同洗脫液時(shí)目標(biāo)多肽的回收率。
[0022]圖2介孔硅材料MCM-41對(duì)pH=7的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品萃取后，采用不同洗脫液時(shí)目標(biāo)多肽的回收率。
[0023]圖3介孔硅材料SBA-15對(duì)pH=3的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品萃取后，以ACN/100mMNH4HCO3 (1:1, v/v)為洗脫液時(shí)目標(biāo)多肽的回收率。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1:MCM_41萃取酸性多肽樣品的洗脫方法
[0025]I)pH=3的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品制備:將8種多肽(pepl_8)的混合標(biāo)樣用20mM的磷酸緩沖溶液(pH=3)溶解，得到濃度為1.125pmol/yL的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
[0026]2)多肽萃取:取500yL10mg/mL介孔硅材料MCM-41 (孔徑:3.5nm,比表面積:800m2/g)的懸浮液于離心管中，離心后，去上清液。加入500 μ L上述多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品，振搖后離心。然后將材料用500 μ L純水清洗兩次。
[0027]3 )負(fù)載多肽的洗脫:將吸附了多肽的材料分別用500 μ L50%ACN、IM NaCl、ACN/10mM NaCl (1:1, v/v)和 ACN/100mM NH4HCO3 (1:1, v/v) (10mM NH4HCO3 的 pH值為 8.0)
進(jìn)行洗脫。洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶，進(jìn)行LC-MS/MS分析。
[0028]4)分析結(jié)果:MCM_41對(duì)pH=3的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品萃取后，采用不同洗脫液時(shí)目標(biāo)多肽的回收率如圖1所示。結(jié)果表明，50%ACN和IM NaCl的洗脫效果都很差，ACN/1OOmMNaCl (1:1, v/v)的效果較好，而ACN/100mM NH4HCO3 (1:1, v/v)效果最好，對(duì)3種分子量較低的多肽 P印3 (P1: 8.22;MW: 758)、pep6(P1:6.74;MW: 897.9)和 pep8(P1:8.59;MW: 1142.7)和 5 種分子量較高的多肽 P印I (P1: 5.99;MW: 1522.4)、pep2(P1:8.75;MW: 1639.4)、P印7 (P1: 6 ;MW: 1773.4)、pep4(P1:4.66;MW:1902.4)和 pep5(P1:4.28;MW:3511.6)的回收率均最高。
[0029]實(shí)施例2:MCM-41萃取中性多肽樣品的洗脫方法
[0030]I) pH=7的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品制備:將以上8種多肽的混標(biāo)用20mM的磷酸緩沖溶液(pH=7)溶解，得到濃度為1.125pmol/yL的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
[0031]2)多肽萃取:取500 μ L10mg/mL介孔娃材料MCM-41 (孔徑:3.5nm，比表面積:800m2/g)的懸浮液于離心管中，離心后，去上清液。加入500 μ L上述多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品，振搖后離心。然后將材料用500 μ L純水清洗兩次。
[0032]3 )負(fù)載多肽的洗脫:將吸附了多肽的材料分別用500 μ L50%ACN、IM NaCl、ACN/10mM NaCl (1:1, v/v)和 ACN/100mM NH4HCO3 (1:1, v/v)進(jìn)行洗脫。洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶，進(jìn)行LC-MS/MS分析。
[0033]4)分析結(jié)果:MCM_41對(duì)pH=7的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品萃取后，采用不同洗脫液時(shí)目標(biāo)多肽的回收率如圖2所示。結(jié)果表明，IM NaCl的洗脫效果最差，50%ACN和ACN/100mMNaCl (1:1, v/v)的效果較好，ACN/1OOmM NH4HCO3(1:1, v/v)效果最好，對(duì)5種酸性多肽p印5、pep4、pepl、pep7和pep6和3種堿性多肽pep3、pep8和pep2的回收率均最高。
[0034]實(shí)施例3 =SBA-15萃取酸性多肽樣品的洗脫方法
[0035]I) pH=3的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備:將以上8種多肽的混標(biāo)用20mM的磷酸緩沖溶液(pH=3)溶解，得到濃度為1.125pmol/yL的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
[0036]2)多肽萃取:取500 μ L10mg/mL介孔娃材料SBA-15 (孔徑:8nm,比表面積:650m2/g)的懸浮液于離心管中，離心后，去上清液。加入500 μ L上述多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品，振搖后離心。然后將材料用500 μ L純水清洗兩次。
[0037]3)負(fù)載多肽的洗脫:將吸附了多肽的材料用ACN/100mM NH4HCO3 (1:1, v/v)進(jìn)行洗脫。洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶，進(jìn)行LC-MS/MS分析。
[0038]4)分析結(jié)果:SBA_15對(duì)pH=3的多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品萃取后，以ACN/100mMNH4HCO3 (1:1, v/v)為洗脫液時(shí)目標(biāo)多肽的回收率如圖3所示。結(jié)果表明，7種目標(biāo)多肽的回收率都大于80%。由于P印6在上清液中有殘留(59.7%，RSD=5.2%)，所以回收率較低，但該洗脫液對(duì)吸附在材料上的部分接近完全洗脫。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種洗脫介孔硅材料表面吸附的多肽的方法，其特征在于:以有機(jī)溶劑與鹽溶液的混合溶液對(duì)吸附在介孔硅材料上的多肽進(jìn)行洗脫，其中，鹽溶液的PH值大于7，且不低于堿性最強(qiáng)的多肽的等電點(diǎn)2個(gè)pH單位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述鹽溶液的濃度為0.05-lmol/L，其中，陽離子為Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、NH4+和N(CH3)4+中的一種或兩種以上，陰離子為0H_、F_、Cl' Br' NO3' SO42' PO43' HCO3^ 和 CH3COCT 中的一種或兩種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述有機(jī)溶劑能與鹽溶液混溶，有機(jī)溶劑為碳數(shù)1-5的一元或二元醇、丙酮、丁酮、乙腈、丙腈、乙酸甲酯和乙酸乙酯中的一種或兩種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述一元或二元醇為甲醇、乙醇、異丙醇、丁二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:有機(jī)溶劑與鹽溶液的體積比為1:50-10:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述多肽的分子量不高于lOKDa。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述介孔硅材料為納米、微米顆?；虮∧?。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種洗脫介孔硅材料表面吸附的多肽的方法，其特征在于：以有機(jī)溶劑與鹽溶液的混合溶液對(duì)吸附在介孔硅材料上的多肽進(jìn)行洗脫，其中，鹽溶液的pH值大于7，且不低于堿性最強(qiáng)多肽的等電點(diǎn)2個(gè)pH單位。方法簡(jiǎn)單可靠，有效解決了介孔硅材料萃取多肽時(shí)回收率低的問題。
【IPC分類】C07K1-14
【公開號(hào)】CN104693268
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310667460
【發(fā)明人】杜燕, 吳大朋, 關(guān)亞風(fēng)
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2013年12月10日