一種用于肺癌診斷的血漿miRNA標(biāo)志物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于肺癌診斷的血漿miRNA標(biāo)志物及應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002] 肺癌目前是全球范圍內(nèi)最常見、致死人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，也是我國第一大 癌癥，其發(fā)病率及死亡率增長最為迅速。由于肺癌起病隱匿，其診治情況遠(yuǎn)不令人滿意，咎 其原因主要在于缺乏早期診斷的手段和有效治療方法?；颊叱霈F(xiàn)癥狀時多為晚期，預(yù)后較 差，總的五年生存率不超過15%，有癥狀者< 10%。但早期確診的肺癌患者，手術(shù)治療的預(yù) 后較中晚期肺癌明顯改善，其生存率可達(dá)70%。由此可見，要降低肺癌病人的死亡率除了在 病因預(yù)防上降低發(fā)病率外，提高早期診斷水平和藥物治療的療效是兩個重要方面。然而，肺 癌的早期診斷一直是一個世界性難題，目前影像診斷（X線、CT和MRI)，化學(xué)診斷（癌反應(yīng)， 血清學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)）及組織細(xì)胞學(xué)診斷是腫瘤診斷的三大支柱，前者在亞臨床期診斷上 有很大局限性，后二者均以腫瘤標(biāo)志物作為觀察指標(biāo)，可以比影像診斷更早發(fā)現(xiàn)腫瘤的存 在，具有高效、高靈敏性、方便、標(biāo)本易獲取及創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，因此，在肺癌早期診治研究中， 篩選及鑒定高特異性的肺癌腫瘤標(biāo)志物一直是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0003] 所謂腫瘤標(biāo)志物，是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞生物合成、釋放或者 是腫瘤與宿主相互作用而產(chǎn)生的一類物質(zhì)，反映著腫瘤的存在和生長。我們可通過利用化 學(xué)、免疫、分子生物學(xué)等技術(shù)對血液或分泌物進(jìn)行定性或者定量的檢測，通過對其分析，幫 助我們從正常組織中區(qū)別腫瘤或者測定腫瘤細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)以及對細(xì)胞膜上的特性進(jìn)行分 析，以此作為辨別腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志。肺癌的發(fā)生與發(fā)展具有十分復(fù)雜的機(jī)制，其發(fā)病的最初 階段涉及到許多肺癌相關(guān)基因及其表達(dá)的改變，在致癌因素的作用下患者體內(nèi)可表達(dá)多種 粘附分子及其受體或配體，在腫瘤發(fā)展的不同時期其釋放標(biāo)志物含量也不一樣，從外周血 和痰液中檢測肺癌特異性分子標(biāo)志物的變化，具有簡便、快捷、痛苦小、易復(fù)查等優(yōu)點(diǎn)，容易 為病人接受，對肺癌的臨床診治具有重要意義。
[0004]由于肺癌組織病理的多樣性、同種病理腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和腫瘤生物學(xué)行為的復(fù) 雜性及多態(tài)性，造成單一標(biāo)志物檢測對肺癌的診斷價值有限，只能反映了疾病某些側(cè)面的 變化，國內(nèi)外眾多學(xué)者傾向于篩選多種有價值的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，以提高肺癌診 斷的陽性率。雖然聯(lián)合檢測優(yōu)于單項檢測已成共識，但并非任意一種組合均能提高臨床診 斷的陽性率，在最佳組合上結(jié)論頗不一致，甚至出現(xiàn)相反的結(jié)果。因此，尋找一種高靈敏度、 高特異性、可實(shí)際應(yīng)用于肺癌臨床診治的生物標(biāo)志物已成為肺癌研究中亟待解決的問題之 〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種用于肺癌診斷的血漿miRNA標(biāo)志物。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種用于肺癌診斷的血漿 miRNA 標(biāo)志物，所述標(biāo)記物包括 miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205 和 miRNA-210。
[0007] 在本發(fā)明的第二方面，提供了上述血漿miRNA標(biāo)志物在制備肺癌診斷試劑盒中的 應(yīng)用。
[0008] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種肺癌診斷試劑盒，其能夠測定血漿中的 miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205 和 miRNA-210 的含量。
[0009] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，上述試劑盒含有miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和 miRNA-210的引物探針。
[0010] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，上述引物探針的序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示。
[0011] 在本發(fā)明的第四方面，提供了核苷序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 或SEQ ID NO. 4中的一種或多種組合物在制備肺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0012] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，提供了序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID N0. 3 和SEQ ID NO. 4所示引物探針的用途，其用于制備肺癌診斷試劑盒。
[0013] 所述診斷試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用試劑，如Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液， dNTPs，MgCljP DEPC水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：首次發(fā)現(xiàn)了對肺癌具有較高診斷價值的生物標(biāo)記物 miR-486、miR-150、miR-205和miR-210四種miRNA ;通過血漿miRNA標(biāo)志物和診斷試劑盒的 研制和應(yīng)用，可以使得肺癌的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為提 高臨床治療效果奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。
【附圖說明】
[0015] 圖1為健康組與肺癌組血漿miRNA表達(dá)水平比較。
[0016] 圖2為健康組與肺癌組血漿miRNA表達(dá)水平R0C曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 一、研究對象
[0018] 病例組為2012年11月至2014年3月在常州市第二人民醫(yī)院收集的11例病例， 均經(jīng)病理組織學(xué)確診，采血前未經(jīng)過手術(shù)和放化療。對照組為同期進(jìn)行社區(qū)疾病篩查的健 康個體11例，按性別和年齡（±5歲）與病例進(jìn)行頻數(shù)匹配。用于研究的樣本為同期收取， 采樣、分裝、保存條件均一，通過對樣品資料的整理。
[0019] 二、研究方法
[0020] (1)使用EDTA抗凝管采肘靜脈血5ml，采血后輕輕搖動抗凝管使抗凝劑與血液混 勻，所有血樣在采血后2小時內(nèi)進(jìn)行RNA提取。先將Ficoll-Paque PLUS液室溫（15-20°C) 放置，所有離心過程也應(yīng)在室溫完成。取2mlEDTA抗凝血與等體積平衡液在15ml離心管中 用移液管（或移液器）充分混勻（總體積4ml)。用針管抽取3mlFi C〇llPaque PLUS溶液到 新的15ml離心管中，輕輕用移液管（或移液器）沿管壁緩慢滴加準(zhǔn)備好的樣品（4ml)于分 層液面上，注意保持清楚的液面。室溫（18-20°C)以400Xg離心30-40分鐘。用新移液管 (或移液器）吸取最上層的血漿與血小板。將血漿置于凍存管中，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｓ蓪?shí)驗(yàn) 員每天定時記錄冰箱溫度。
[0021 ] ⑵按照血液總RNA快速提取試劑盒（miRNeasy血楽提取試劑盒，貨號 NO. 217184,德國Qiagen公司）說明書從血漿中提取總RNA。為了避免由于抽提步驟導(dǎo)致 RNA含量的誤差，加入線蟲合成miR-39 (血漿外參試劑盒，貨號NO. 219610,德國Qiagen公 司）作為外參進(jìn)行正太化校正。
[0022] (3)按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，貨號 NO. 1302146R，美國ABI公司）說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)總體積為15ul (總RNA5ul， TaqMan MicroRNA Assay 3ul,核酸酶自由水 4. 16ul，RNase 抑制劑 0? 19ul，緩沖液 1. 5ul， Multiscribe 逆轉(zhuǎn)錄酶 1. OOul 和 dNTPO. 15ul)，在不同溫度下（16°C，42°C，85°C，4°C )進(jìn)行 不同時長（30mins，30mins，5mins，10mins)反應(yīng)。
[0023] (4)實(shí)時熒光定量PCR按照TaqMan試劑盒（TaqMan通用混合試劑盒II，貨號 N0. 121207,美國ABI公司）說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系總體積為10ul，反應(yīng)共40個循環(huán)。 PCR反應(yīng)Ct值通過7900實(shí)時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）測定，每個反應(yīng)重復(fù)三次。
[0024] 三、研究結(jié)果
[0025] 病例組血漿miR-486、miR-150、miR-210表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)；而miR-205 表達(dá)水平較對照組顯著下降。具體數(shù)據(jù)如表1和圖1所示：
[0026] 表1 :對照組與病例組血漿miRNA水平比較（A CT) (X土 S)
【主權(quán)項】
1. 一種用于肺癌診斷的血漿miRNA標(biāo)志物，其特征在于所述標(biāo)記物包括miRNA-486、 miRNA-150、miRNA-205 和miRNA-210。
2. -種如權(quán)利要求1所述的用于肺癌診斷的血漿miRNA標(biāo)志物在制備肺癌診斷試劑盒 中的應(yīng)用。
3. -種肺癌診斷試劑盒，其特征在于能夠測定血漿中的miRNA-486、miRNA-150、 miRNA-205 和miRNA-210 的含量。
4. 如權(quán)利要求3所述的肺癌診斷試劑盒，其特征在于含有miRNA-486、miRNA-150、 miRNA-205 和miRNA-210 的引物探針。
5. -種如權(quán)利要求4所述的肺癌診斷試劑盒，其特征在于引物探針的序列如SEQID NO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4 所示。 6?核苷序列如SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 或SEQIDNO. 4 中的一種或 多種組合物在制備肺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于肺癌診斷的血漿miRNA標(biāo)志物及應(yīng)用。本發(fā)明提供了用于肺癌診斷的血漿miRNA標(biāo)志物，包括miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和miRNA-210；本發(fā)明還提供了序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物探針及其在制備肺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于發(fā)現(xiàn)了對肺癌具有較高診斷價值的生物標(biāo)記物，對肺癌具有較高診斷價值(AUC為0.975，敏感度和特異度分別為90.9％和100％)。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-113
【公開號】CN104694623
【申請?zhí)枴緾N201410837946
【發(fā)明人】盧正斌
【申請人】常州杰傲病理診斷技術(shù)有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2014年12月29日