鼠的實時熒光pcr物種成分檢測方法及其檢測引物、探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鼠的實時熒光PCR檢測方法，使用TaqMan探針實時熒光PCR檢測技 術(shù)，對鼠進行物種成分檢測，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，肉和肉制品的摻雜摻假事件頻頻被媒體曝光，已經(jīng)成為中國食品質(zhì)量控 制面臨的重要挑戰(zhàn)之一。不法分子將價格相對廉的豬肉、雞肉、鴨肉冒充牛肉、羊肉銷售。近 日有報道稱，不法商販將老鼠肉摻入牛羊肉中進行銷售。老鼠作為疫病的傳播源，加工食用 對健康風(fēng)險很大。動物物種成分檢測是打擊肉制品制假摻假的有效手段，但目前并沒有一 種針對鼠成分的高效準(zhǔn)確的檢測方法。
[0003] 形態(tài)學(xué)方法是傳統(tǒng)的動物種屬鑒定方法，然而受其準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，已不能 滿足對肉制品等一系列動物制品摻假現(xiàn)象的監(jiān)管與控制的需求。種屬鑒定的免疫學(xué)方法大 都直接鑒定樣本中的蛋白成分，其基本原理是抗體抗原反應(yīng)，但免疫學(xué)方法存在對樣本材 料要求高，檢測準(zhǔn)確率低等缺陷，如動物食品若經(jīng)過加熱、腌制等處理，其蛋白結(jié)構(gòu)一旦遭 到破壞，免疫學(xué)方法便不再適用。而分子生物學(xué)方法，基于核酸等遺傳物質(zhì)的高穩(wěn)定性和多 樣性等特點，已被廣泛應(yīng)用于物種種屬鑒定，特別是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的核酸檢測方法被 應(yīng)用到物種鑒別已有20年的歷史。實時熒光PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用 熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過擴增曲線對結(jié)果進行分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種鼠的實時熒光PCR物種 成分檢測方法，本發(fā)明的第二個目的是提供上述方法的檢測引物和探針，本發(fā)明的第二個 目的是提供上述方法的試劑盒。本方法由于其引物和探針具有很高的特異性和靈敏度，且 所涉及的鼠種皆為我國常見種類，可協(xié)助有關(guān)部門有效打擊肉及肉制品制假販假的惡劣行 徑。
[0005] 為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0006] 鼠的實時熒光PCR物種成分檢測方法，該方法包括以下的步驟：
[0007] 1)樣本DNA提??；
[0008] 2)實時熒光PCR擴增檢測；
[0009] 實時熒光PCR反應(yīng)體系如下：10ul Premix Ex Taq，上游引物0.4ul，下游引物 0. 4ul，探針0. 4ul，上游引物、下游引物和探針濃度均為10pmol/y 1 ;上游引物的序列為 AAAY*CCAACTTATATGTGAAAAITCAITGT，下游引物的序列為AGTACCGCCAAGTCCITTGA，探針的序 列為FAM-TACCCCACTATGCTTAGCC-Eclipse，所述的Y*表示兼并堿基C或T ;取上述提取的 DNA液lul，用水補足體積至20ul ;應(yīng)用熒光定量PCR儀lightcycle 480進行反應(yīng)，反應(yīng)程 序為（1) 95°C，lOsec ; (2) 95°C，5sec ;6(TC，23sec ;40個循環(huán)；
[0010] 3)結(jié)果判定；Ct值小于等于35時，結(jié)果為陽性，Ct值大于35時為陰性。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的樣本DNA提取的方法如下：取0. 2g鼠肉，在液氮中充分研磨后， 使用DNA抽提試劑盒進行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在100ul水中。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的DNA抽提試劑盒采用Promega FF3750。
[0013] 為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0014] 鼠的實時熒光PCR物種成分檢測用引物和探針，上游引物的序列為 AAAY*CCAACTTATATGTGAAAAITCAITGT，下游引物的序列為 AGTACCGCCAAGTCCITTGA，探針的序 列為 FAM-TACCCCACTATGCTTAGCC-Eclipse，所述的 Y*表示兼并堿基 C 或 T。
[0015] 為了實現(xiàn)上述的第三個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0016] 鼠的實時熒光PCR物種成分檢測用試劑盒，該試劑盒包括上游引物、下游引物和 探針，所述的上游引物的序列為AAAY #CCAACTTATATGTGAAAATTCATTGT，下游引物的序列為 AGTACCGCCAAGTCCITTGA，探針的序列為 FAM-TACCCCACTATGCTTAGCC-Eclipse，所述的 Y* 表示 兼并堿基C或T。
[0017] 本發(fā)明基于具有高度物種特異性的鼠線粒體12S核糖體RNA(12S ribosomal RNA)序列（基因序列號：KC663621. 1、FQ210435. 1、AJ005780. 1 和 AJ311140. 1)設(shè)計 了鼠科（Muridae)鼠亞科（Murinae)內(nèi)具有小家鼠（Mus musculus)、褐家鼠（Rattus norvegicus)、黑家鼠（Rattus rattus)、黃胸鼠（Rattus flavipectus)、黑線姬鼠 (Apodemus agrarius)等物種特異性的引物和探針，實現(xiàn)以Real-time PCR的方法對上述鼠 種進行物種成分檢測。本方法由于其引物和探針具有很高的特異性和靈敏度，且所涉及的 鼠種皆為我國常見種類，因此本發(fā)明可協(xié)助有關(guān)部門有效打擊肉及肉制品制假販假的惡劣 行徑。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1:引物和探針的設(shè)計
[0019] 基于具有高度物種特異性的鼠12S核糖體RNA(12S ribosomal RNA)序列（基因序 列號：KC663621. 1、FQ210435. 1、AJ005780. 1和AJ311140. 1)，用生物信息學(xué)方法對上述序 列進行比對，并根據(jù)引物設(shè)計原則，利用Primer Express設(shè)計軟件，設(shè)計出特異性引物和熒 光探針若干組。將設(shè)計得到的引物和探針--進行BLAST驗證（http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/)，以保證引物的高特異性。經(jīng)過上述驗證，最后選擇了如表1所示的引物和探針， 并在探針上標(biāo)記了熒光信號，以實現(xiàn)實時熒光檢測。
[0020] 表1鼠的熒光Real-time PCR物種成分檢測的引物和探針
[0021]
【主權(quán)項】
1. 鼠的實時熒光PCR物種成分檢測方法，其特征在于該方法包括以下的步驟： 1) 樣本DNA提??； 2) 實時熒光PCR擴增檢測； 實時熒光PCR反應(yīng)體系如下：10ulPremixExTaq，上游引物0.4ul，下游引物 0. 4ul，探針0. 4ul，上游引物、下游引物和探針濃度均為10pmol/y1 ;上游引物的序列為 AAAY*CCAACTTATATGTGAAAAITCAITGT，下游引物的序列為AGTACCGCCAAGTCCITTGA，探針的序 列為FAM-TACCCCACTATGCTTAGCC-Eclipse，所述的Y*表示兼并堿基C或T;取上述提取的 DNA液Iul，用水補足體積至20ul;應(yīng)用熒光定量PCR儀Iightcycle480進行反應(yīng)，反應(yīng)程 序為（1) 95°C，10sec;(2) 95°C，5sec; 60°C，23sec;40 個循環(huán)； 3) 結(jié)果判定；Ct值小于等于35時，結(jié)果為陽性，Ct值大于35時為陰性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠的實時熒光PCR物種成分檢測方法，其特征在于樣本DNA 提取的方法如下：取〇. 2g鼠肉，在液氮中充分研磨后，使用DNA抽提試劑盒進行DNA抽提， 抽提后的DNA溶解在IOOul水中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鼠的實時熒光PCR物種成分檢測方法，其特征在于DNA抽提 試劑盒采用PromegaFF3750。
4. 鼠的實時熒光PCR物種成分檢測用引物和探針，其特征在于：上游引物的序列為 AAAY*CCAACTTATATGTGAAAAITCAITGT，下游引物的序列為AGTACCGCCAAGTCCITTGA，探針的序 列為FAM-TACCCCACTATGCTTAGCC-Eclipse，所述的Y*表示兼并堿基C或T。
5. 鼠的實時熒光PCR物種成分檢測用試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括上游引物、下 游引物和探針，所述的上游引物的序列為AAAYtCAACTTATATGTGAAAATTCATTGT，下游引物的 序列為AGTACCGCCAAGTCCITTGA，探針的序列為FAM-TACCCCACTATGCTTAGCC-Eclipse，所述 的疒表示兼并堿基C或T。
【專利摘要】本發(fā)明涉及鼠的實時熒光PCR檢測方法，使用TaqMan探針實時熒光PCR檢測技術(shù)，對鼠進行物種成分檢測，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。鼠的實時熒光PCR物種成分檢測方法，該方法包括以下的步驟：1）樣本DNA提??；2）實時熒光PCR擴增檢測；3）結(jié)果判定；Ct值小于等于35時，結(jié)果為陽性，Ct值大于35時為陰性。本方法由于其引物和探針具有很高的特異性和靈敏度，且所涉及的鼠種皆為我國常見種類，因此本發(fā)明可協(xié)助有關(guān)部門有效打擊肉及肉制品制假販假的惡劣行徑。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104694632
【申請?zhí)枴緾N201510061450
【發(fā)明人】吳姍, 曹新前, 虞惠貞, 吳昺
【申請人】浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月5日