一種基于dna銀納米簇均相篩選g-四鏈體配體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物篩選的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于DNA-銀納米簇均相 篩選G-四鏈體配體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 端粒是由端粒DNA和端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成的。端粒DNA是位于染色體末端并對(duì)染 色體具有保護(hù)作用的富含鳥(niǎo)嘌呤（G)的DNA重復(fù)序列，它由富GT鏈與富CA鏈配對(duì)的雙螺 旋結(jié)構(gòu)和一段3'末端懸突的富G單鏈的重復(fù)序列組成，人類端粒DNA為5' -TTAGGG-3' 重復(fù)序列。端粒酶是一種依賴于RNA的特殊聚合酶，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基（hTERT)、端粒 酶RNA和端粒酶其他聚合蛋白組成。端粒酶能以自身的RNA作為模板，在染色體末端合成 端粒序列，從而保持端粒長(zhǎng)度穩(wěn)定，使細(xì)胞永生化。研宄發(fā)現(xiàn)，端粒酶在正常體細(xì)胞中幾 乎沒(méi)有表達(dá)，但是在85%以上的癌癥細(xì)胞中，端粒酶卻呈陽(yáng)性表達(dá)，而且進(jìn)一步的研宄說(shuō) 明，腫瘤細(xì)胞分化程度與端粒酶的活性直接相關(guān)，這表明端粒酶與腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及 快速增殖可能存在密切的關(guān)系（Shay J.W., Wright W.E.Telomerase therapeutics for cancer:challenges and new directions[J]. Nat. Rev. Drug Discov.2006, 5:577 - 584.), 因此惡性腫瘤與端粒酶的活性之間具有高度的相關(guān)性。
[0003] 富含G的端粒DNA單鏈在K+、Na+等離子以及一些藥物分子的存在下可以通過(guò)G堿 基之間的Hoogsteen環(huán)狀氫鍵形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)（Hupper J. L. , Balasubramanian S.Prevalence of quadruplexes in the human genome[J]. Nucleic. Acids. Res. 2005, 33(9) : 2908 - 2916.)。G-四鏈體的形成可以阻止端粒酶對(duì)端粒DNA序列的識(shí)別， 從而抑制端粒酶的活性。端粒酶活性的抑制可使腫瘤細(xì)胞端粒縮短直至細(xì)胞停止增殖，轉(zhuǎn) 入細(xì)胞凋亡過(guò)程，從而抑制腫瘤的發(fā)展。因此這一發(fā)現(xiàn)使G-四鏈體成為端粒酶抑制劑作用 的新靶點(diǎn)，對(duì)于能夠誘導(dǎo)形成或增強(qiáng)G-四鏈體穩(wěn)定性的小分子化合物則很有可能對(duì)癌癥 的治療具有潛在的意義。
[0004] 在已報(bào)道的研宄工作中，X-射線衍射、表面等離子體共振（SPR)、核磁共振（NMR)、 等溫滴定量熱法（ITC)、電噴霧質(zhì)譜法（ESI-MS)、凝膠電泳等多種分析方法被用來(lái)研宄 G-四鏈體及其配體的篩選。但是現(xiàn)在常用的方法均存在操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，成本較高、所要求 的實(shí)驗(yàn)條件較為苛刻等不足，因此，探尋一種低成本、簡(jiǎn)單操作且結(jié)果可靠的G-四鏈體及 配體的篩選方法是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服已有的技術(shù)的缺點(diǎn)，構(gòu)建一種普適性強(qiáng)、低成 本、響應(yīng)快速、靈敏可靠的基于DNA銀納米簇均相篩選G-四鏈體配體的方法。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是由下述步驟組成：
[0007] (1)用10mm〇l/LpH = 8.0的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩沖溶液將單鏈核酸探針 配制為100 y mol/L的儲(chǔ)備液備用，該單鏈核酸探針的序列為：5'-CCCCCCCCCCCCTTTTTTTA GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'，再用相同方法將100 y mol/L單鏈核酸探針儲(chǔ)備液濃度稀釋 后加入原濃度為10mm〇l/L的硝酸銀溶液，冰上孵育10~15分鐘，再加入原濃度為lOmmol/ L的硼氫化鈉溶液，使單鏈核酸探針在終混合液中的濃度達(dá)到20 y mol/L，單鏈核酸探針與 硝酸銀、硼氫化鈉的終濃度之比為1:5:5~1:12:12,混勻至反應(yīng)完全，得到DNA-銀納米簇 溶液；
[0008] (2)用10mm〇l/L pH = 8. 0三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩沖溶液將DNA-銀納米簇溶 液的濃度稀釋至1. 0 U mol/L，在激發(fā)波長(zhǎng)為460~470nm條件下檢測(cè)其初始焚光值，并記錄 為F〇;
[0009] (3)在步驟⑵的基礎(chǔ)上加入中藥單體溶液至中藥單體在混合液中的最終濃度達(dá) 到20 ymol/L，混勻，待反應(yīng)完全后在與步驟（2)相同的激發(fā)波長(zhǎng)條件下檢測(cè)其反應(yīng)后的熒 光值，并記錄為F ;若熒光強(qiáng)度值降低，則表明該中藥單體可以誘導(dǎo)DNA-銀納米簇的端粒識(shí) 別序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，該中藥單體為G-四鏈體配體；若否，則相反，其不屬于G-四鏈 體配體，從而實(shí)現(xiàn)G-四鏈體配體的均相篩選。
[0010] 上述步驟（1)中單鏈核酸探針與硝酸銀、硼氫化鈉的終濃度比為1 :6 :6。
[0011] 上述步驟（3)篩選的G-四鏈體配體為蘆薈大黃素衍生物3、白楊素、大豆苷元、槲 皮素、大黃素、蘆薈大黃素、山奈酚、大黃酚、芹菜素以及木犀草素的中藥單體。
[0012] 上述單鏈核酸探針是由5'末端12個(gè)胞嘧啶、3'末端d(TTAGGG)4以及5個(gè)胸腺 嘧啶相鏈接構(gòu)成。
[0013] 本發(fā)明提供的一種基于DNA銀納米簇均相篩選G-四鏈體配體的方法，其基于富G 單鏈和G-四鏈體對(duì)DNA-銀納米簇?zé)晒庑盘?hào)具有不同的影響，結(jié)合人類端粒DNA本身就是 富G序列，通過(guò)端粒DNA與其配體相互作用前后由單鏈轉(zhuǎn)化為四鏈體構(gòu)型進(jìn)而引起銀納米 簇?zé)晒庑盘?hào)的變化均相篩選G-四鏈體配體，本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)便、響應(yīng)快速、靈敏 可靠、普適性強(qiáng)、易于推廣而且成本較低的特點(diǎn)，而且通過(guò)細(xì)胞熒光成像實(shí)驗(yàn)和MTT細(xì)胞增 殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的方法所篩選出G-四鏈體配體的確可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其 對(duì)于以G-四鏈體為靶點(diǎn)的小分子端粒酶抑制劑的研宄和抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)、腫瘤的臨床 治療等具有重要的理論意義和實(shí)際意義。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為合成的5. 0 y mol/L DNA-銀納米簇的透射電子顯微鏡結(jié)果；
[0015] 圖2為1. 0 y mol/L DNA-銀納米簇的激發(fā)和發(fā)射光譜圖；
[0016] 圖3為1. 0 ymol/L DNA-銀納米簇與10 ymol/L蘆薈大黃素衍生物3(AED3)作用 前后的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜對(duì)比圖；
[0017] 圖4為l.Oymol/LDNA-銀納米簇與10ym〇l/L苦參堿作用前后的熒光激發(fā)和發(fā) 射光譜對(duì)比圖；
[0018] 圖5為不同中藥單體作用于DNA-銀納米簇后熒光信號(hào)變化的柱狀圖，匕代表單獨(dú) DNA-銀納米簇的信號(hào)，F(xiàn)代表加入中藥單體后的熒光信號(hào)；
[0019]圖6為人端粒DNA分別與蘆薈大黃素衍生物3和苦參堿作用后的圓二色光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 以蘆薈大黃素衍生物3 (AED3)為例，篩選其是否為G-四鏈體配體的方法由以下步 驟組成：
[0023] (1)按照常規(guī)方法制得濃度為10mm〇l/LpH=8.0的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩 沖溶液，用該緩沖溶液將單鏈核酸探針（12C5TG，序列為：5' -CCCCCCCCCCCCTTTTTTTAGGGT TAGGGTTAGGGTTAGGG-3')配制成濃度為 100 y mol/L 的儲(chǔ)備液，備用；向 155. 2 y L lOmmol/ LpH=8.0三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩沖溶液中加入40 y L 100 ymol/L單鏈核酸探針儲(chǔ) 備液，向單鏈核酸探針稀釋液中加入2. 4 y L 10mm〇l/L硝酸銀溶液，冰上孵育15分鐘，快速 向以上混合溶液中加入2. 4 y L 10mmol/L硼氫化鈉，使單鏈核酸探針在終混合液中的濃度 達(dá)到20 ymol/L，單鏈核酸探針、硝酸銀和硼氫化鈉的最終濃度比例是1 :6 :6,在漩渦振蕩 器中劇烈震蕩1分鐘，至反應(yīng)完全，得到DNA-銀納米簇溶液，4°C避光放置。
[0024] 將所得DNA-銀納米簇溶液用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察表征，如圖1，由圖1可以 看出該DNA-銀納米簇分散均勻，與已有的文獻(xiàn)（馬坤.DNA-Ag納米簇旳合成及生物傳感研 宄.浙江師范大學(xué).碩士畢業(yè)論文）報(bào)道一致，證明確實(shí)合成了 DNA銀納米簇。
[0025] 進(jìn)一步，為了表征本實(shí)施例合成的DNA-銀納米簇具有熒光特性，用普通的熒光測(cè) 試儀通過(guò)對(duì)DNA-銀納米簇激發(fā)和發(fā)射光譜的檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，該DNA-銀納米簇的最 大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)分別在470nm和564nm，且具有較高的熒光強(qiáng)度，表明該DNA-銀 納米簇具有良好的熒光特性。
[0026] (2)用10mm〇l/LpH= 8. 0三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩沖溶液將DNA-銀納米簇溶 液濃度稀釋至1. 〇 U mol/L，在激發(fā)波長(zhǎng)為470nm條件下檢測(cè)其初始熒光值，并記錄為F。。
[0027] (3)向步驟⑵的DNA-銀納米簇稀釋液中加入10 y mol/L的蘆薈大黃素衍生物 3 (AED3
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于DNA銀納米簇均相篩選G-四鏈體配體的方法，其特征在于由以下步驟組 成： (1) 用lOmmol/LpH=8. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩沖溶液將單鏈核酸探針配制 為100ymol/L的儲(chǔ)備液備用，該單鏈核酸探針的序列為：5' -CCCCCCCCCCCCTTTTTTTAGGG TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'，再用相同方法將100ymol/L單鏈核酸探針儲(chǔ)備液濃度稀釋后 加入原濃度為lOmmol/L的硝酸銀溶液，冰上孵育10~15分鐘，再加入原濃度為lOmmol/L 的硼氫化鈉溶液，使單鏈核酸探針在終混合液中的濃度達(dá)到20ymol/L，單鏈核酸探針與硝 酸銀、硼氫化鈉的終濃度之比為1:5:5~1:12:12,混勻至反應(yīng)完全，得到DNA-銀納米簇溶 液； (2) 用lOmmol/LpH= 8. 0三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩沖溶液將DNA-銀納米簇溶液 的濃度稀釋至1. 〇Umol/L，在激發(fā)波長(zhǎng)為460~470nm條件下檢測(cè)其初始焚光值，并記錄為 F0; (3) 在步驟（2)的基礎(chǔ)上加入中藥單體溶液至中藥單體在混合液中的最終濃度達(dá)到 20ymol/L，混勻，待反應(yīng)完全后在與步驟（2)相同的激發(fā)波長(zhǎng)條件下檢測(cè)其反應(yīng)后的熒光 值，并記錄為F;若熒光強(qiáng)度值降低，則表明該中藥單體可以誘導(dǎo)DNA-銀納米簇的端粒識(shí)別 序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，該中藥單體為G-四鏈體配體；若否，則相反，其不屬于G-四鏈體 配體，從而實(shí)現(xiàn)G-四鏈體配體的均相篩選。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNA銀納米簇均相篩選G-四鏈體配體的方法，其特征在 于：所述步驟（1)中單鏈核酸探針與硝酸銀、硼氫化鈉的終濃度比為1 :6 :6。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNA銀納米簇均相篩選G-四鏈體配體的方法，其特征在 于：所述步驟（3)篩選的G-四鏈體配體為蘆薈大黃素衍生物3、白楊素、大豆苷元、槲皮素、 大黃素、蘆薈大黃素、山奈酚、大黃酚、芹菜素以及木犀草素的中藥單體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNA銀納米簇均相篩選G-四鏈體配體的方法，其特征在 于：所述單鏈核酸探針是由5'末端12個(gè)胞嘧啶、3'末端d(TTAGGG)4以及5個(gè)胸腺嘧啶相 鏈接構(gòu)成。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于DNA銀納米簇均相篩選G-四鏈體配體的方法，其是在稀釋的單鏈核酸探針溶液中先后加入硝酸銀溶液，冰上孵育后，再加入硼氫化鈉溶液，先得到DNA-銀納米簇溶液；在460～470nm條件下檢測(cè)DNA-銀納米簇溶液在加入中藥單體前后的熒光強(qiáng)度，若加入中藥單體后熒光強(qiáng)度降低，則說(shuō)明該中藥單體可以誘導(dǎo)DNA-銀納米簇的端粒識(shí)別序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，該中藥單體為G-四鏈體配體；否則，相反，從而實(shí)現(xiàn)G-四鏈體配體的均相篩選。本發(fā)明的篩選方法具有操作簡(jiǎn)便、響應(yīng)快速、靈敏可靠、普適性強(qiáng)、易于推廣而且成本較低的特點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104694633
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510063935
【發(fā)明人】金燕, 成銳, 張琦
【申請(qǐng)人】陜西師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年2月6日