梔子的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種梔子的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 梔子，或藥用梔子，（學(xué)名：GardeniajasminoidesEllis)，是茜草科植物梔子的 果實(shí)。梔子的果實(shí)是傳統(tǒng)中藥，屬我國(guó)衛(wèi)生部（現(xiàn)計(jì)衛(wèi)委）頒布的第1批藥食兩用資源， 具有利膽、降壓、鎮(zhèn)靜、護(hù)肝、止血、消腫等作用。在中醫(yī)臨床常用于治療扭挫傷、黃疸型肝 炎、高血壓、糖尿病等癥。水梔子是梔子藥材常見(jiàn)的偽品，水桅子為茜草科植物大花桅子 (GardneaijasminoidesEllisgrandifloraNakai)干燥成熟果實(shí)，近幾年的全國(guó)各地大 量種植，原來(lái)主要作為染料和色素，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)常被當(dāng)作梔子使用。其作傷科外敷藥，不可內(nèi)服。 隨著野生資源的減少，相應(yīng)的偽品也在商品市場(chǎng)上更多地出現(xiàn)。梔子和偽品水梔子來(lái)源相 近，兩者特征接近，鑒別難度大。實(shí)際中常通過(guò)外觀形狀進(jìn)行鑒別，但鑒別難度較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種新的、方便準(zhǔn)確的梔子檢測(cè)試劑盒 和檢測(cè)方法。
[0004] 本發(fā)明提供了SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。
[0005] 本發(fā)明提供了檢測(cè)SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的試劑在制備梔子檢測(cè)試劑中的 用途。
[0006] 其中，所述檢測(cè)試劑包括擴(kuò)增SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的試劑。
[0007] 其中，所述擴(kuò)增的試劑包括SEQIDNO. 2~3所示的引物對(duì)。
[0008] 本發(fā)明提供了檢測(cè)梔子的試劑盒，包括檢測(cè)SEQIDNO. 1所述核苷酸序列的相關(guān) 試劑。
[0009] 其中，所述試劑包括擴(kuò)增SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的試劑。
[0010] 其中，所述擴(kuò)增的試劑包括SEQIDNO. 2~3所示的引物對(duì)。
[0011] 本發(fā)明提供了梔子的檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0012] a，提取樣本DNA:提取待檢樣本中的DNA;
[0013] b，檢測(cè)：用前述的試劑盒檢測(cè)待檢樣本，即可。
[0014] 本發(fā)明SEQIDNO. 1所示核苷酸序列為梔子特異性標(biāo)記序列，通過(guò)檢測(cè)這些序列 可以有效區(qū)分梔子和水梔子，鑒定待檢樣本是否為梔子，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，具有良好的 應(yīng)用前景。
[0015] 下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限 制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述 基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，都是本發(fā)明保護(hù)的內(nèi) 容。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1.梔子DNA的改良RAro擴(kuò)增。通道1-6為水梔子分別來(lái)源于江西，福建，貴州， 四川，湖南，浙江，通道7為采自瀘州的梔子。箭頭所指的為用于克隆的梔子的A1-1片段。 通道"M"顯示有分子重量（bp)的DL2000DNA標(biāo)記。
[0017] 圖2.陽(yáng)性克隆的菌落PCR鑒定。通道1-7為梔子A1片段的不同克隆。通道"M" 顯示有分子重量（bp)的DL2000DNA標(biāo)記。藍(lán)色所指通道1的克隆A1-1用于酶切鑒定和 Sanger測(cè)序。
[0018] 圖3.陽(yáng)性克隆的酶切鑒定。通道1為梔子A1-1克隆質(zhì)粒DNA沒(méi)有酶切，通道2 為梔子A1-1克隆的質(zhì)粒DNA用EcoRI酶切，通道"M"顯示有分子重量（bp)的DL2000DNA 記D
[0019] 圖4.梔子鑒定。藍(lán)色所指的通道7的為梔子。通道1-6號(hào)樣本分別是來(lái)自于江 西、陜西、江蘇、四川、湖南和浙江的水梔子花樣本DNA。通道7的為梔子樣本DNA。通道8-17 按順序?yàn)闃颖窘疸y花、趕黃草，靈芝，荔枝，桂圓，龍荔，銀杏，當(dāng)歸，青果，天麻的DNA。通道 18為沒(méi)有任何樣本DNA陰性對(duì)照。通道"M"顯示有分子重量（bp)的DL2000DNA標(biāo)記。
[0020] 圖5.梔子和水梔子的區(qū)分。SCAR標(biāo)記A1-1在不同梔子花DNA擴(kuò)增。通道1_3號(hào) 分別是來(lái)自于湖南和浙江的水梔子花，和瀘州的梔子樣本。通道"M"顯示有分子重量（bp) 的DL2000DNA標(biāo)記。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1RAPD技術(shù)擴(kuò)增梔子特異SCAR標(biāo)記
[0022] 一、DNA提取
[0023] 收集6個(gè)地方的水梔子（江西，福建，貴州，四川，湖南，浙江）和野生的梔子（瀘 州）樣本，將干組織約〇. 2g置于1. 5mLEP管中，加入液氮約半分鐘后用鑷子碾碎成細(xì)粉， 立即加入 500y1CTAB提取緩沖液[CTAB2%，Tris-HCl(pH8. 0) 100mmol/L，EDTA20mmol/L， NaCL1. 4mol/L，0. 4%的-巰基乙醇]，60°C水浴保溫1小時(shí)后，加入等體積的氯仿-異 戊醇（24 :1)抽提，輕顛倒混勻，10000r.min-l離心lOmin，吸取上清液，取上清加入2/3 體積的預(yù)冷的異丙醇，輕輕上下顛倒混勾；12000r/min離心10min，棄上清，小心傾去上清 液，沉淀用70%乙醇和無(wú)水乙醇各輕洗一次，棄洗液，留沉淀?yè)]干。用100y1的TE溶解備 用。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量，將樣品濃度稀釋至10ng/y1，-20°C保存 備用。
[0024]二、RAPD技術(shù)PCR擴(kuò)增
[0025]RAPD技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)RATO引物A1擴(kuò)增（5-CAGGCCCTTC-3)。
[0026]PCR體系：lyl引物（2.5ymol/L)，1.5yl(15ng)模板DNA，5yl的 2XPCRTaq Mastermix(天根生物公司，北京）和2. 5y1雙蒸水。
[0027]PCR反應(yīng)條件是：95°C1分30秒，94°C40秒，36度60秒，72°C1分30秒，40個(gè)循 環(huán)，最后72°C5分，其中RAMP為5%。
[0028] PCR儀器用Applied BiosystemsVeriti?96-WellThermal Cycler。然后用 1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，曝光。
[0029] 瓊脂糖凝膠電泳：
[0030] (1)脂糖凝膠的配置：用電子天平稱取〇.8g瓊脂粉，加入1XTAE40ml，放入微波 爐中充分溶解（中火至沸騰，中低火至沸騰2次），置于實(shí)驗(yàn)桌上，加入EB2y1，混勻，待冷 卻至50°C備用；
[0031] (2)用0.75mm16孔寬齒梳，配制膠板，將制膠板放入制膠槽中，將溶解的瓊脂糖 (約50°C)，倒入其中，直至厚度為6_(如有氣泡要把氣泡趕出），待其在室溫下充分凝固 后備用；
[0032] (3)點(diǎn)樣：
[0033] (4)100V電泳 45min。
[0034] 三、RAPD擴(kuò)增條帶的分離
[0035] 1.片段回收
[0036] 1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在紫外線下割下圖1箭頭所指的A1-1片梔子 特有的片段，利用DNA瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生物公司），回收片段。
[0037] 2?克隆
[0038]接著利用PGEM-T載體（PromegaCorporation)，T4-DNA連接酶連接（16°C連接 8 小時(shí)），連接后加入30y1的DH5a感受態(tài)細(xì)菌，冰浴30分鐘，然后42°C45秒，冰浴2min， 然后加入300y1無(wú)氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基200r/min搖動(dòng)45min，然后將液體加入含氨芐 青霉素的固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí)。
[0039] 3.陽(yáng)性克隆鑒定
[0040] 進(jìn)行藍(lán)白篩選，篩選白色菌落進(jìn)行菌落PCR。挑選一個(gè)白色菌落，加入300y1含氨 芐青霉素的LB培養(yǎng)基，220r.min2-3小時(shí)，取0. 5y1培養(yǎng)基進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系是： PCRmix5yl，DNA0.5yl,引物（SP6+T7)0.5yl，水 4yl。PCR反應(yīng)條件是PCR:95°C1 分30秒，94°C40秒，58°C30秒，72°C40秒，30個(gè)循環(huán)，最后72°C5分。
[0041] 4.PCR陽(yáng)性克隆做酶切鑒定，具體詳見(jiàn)《精編醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》（中國(guó)醫(yī) 藥科技出版社，主編：傅俊江）。
[0042] 5?結(jié)果
[0043] 圖2為陽(yáng)性克隆的菌落PCR鑒定，其中通道1-7為梔子A1片段的不同克??；取通 道1的陽(yáng)性克隆A1-1用于酶切鑒定和Sanger測(cè)序。
[0044] 圖3為陽(yáng)性克隆A1-1的酶切鑒定。通道1為梔子A1-1克隆質(zhì)粒DNA沒(méi)有酶切， 通道2為梔子A1-1克隆質(zhì)粒DNA的EcoRI酶切。
[0045] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，獲得了陽(yáng)性克隆。
[0046] 五、測(cè)序分析
[0047] 1、測(cè)序
[0048] 挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序獲得的847bp的核苷酸序列，序列（SEQID NO. 1)如下：
[0049] AGGCCCTTTCAGACGTTACAGTTTTTACAAGATGTTGACTGAGAATGCGGCCGTATACATATAACATTG CTGTGAAGAAGAAATGCCTGGAACAACACATGATCTTAGTTTTAGACCTTAATCTTCTGCCCTAAGGACTTAACAAG CCTTCAAAACGAGAAGGAAGGGCATACTGTATGCTGAATTTGATCAATATTACCAGTTTAGTAGCCTAAATCCTGGA AGATGCCGCTCCTCATTGACTCTTCTCGATAAACTGAATAGCTCTCCAGTCATGAATATTTGGATGACAACCACCAT GGCACAGATATAAAGATGACCCATGTAAAGAATGAATAATATACTTATAAGCATCCAAAACGTAGAAGATGTGCGAA TCCACATTGATCTGTACTTGTTCTCGTCATCAACGAGTAAATAGCTTCCGCTTAATTTGCGTACATCCGGAAAAGAC TGGAAATGTAAAAAGGAAAAAGAGAATGAAGTGTTTAGTTTTCTAAATAAACCATGAAAGTTGAGGAGGACTAAATG TTTTACATGGCGGAGAAAATTTTAGACAAAATGCACTGTTTGGATTAACTGCAAGCCAACCTGCAGCCGTAACAAGT AATTTTACTTTAAAAATTTCTGCGGTGGCAAAACAAGACATGCAAAATCGTGGCTTCTCCCAAAAAGCAAAAACAGA AGCATAAGTCCAAATGCTGCCAACCTCATTCAGTTATGACATGCTGGTAGTATTGAAAGGGAACTAAATGATGGGAT AAATGTGTAAAAAGTGCGACTTGTGAATTAAAGGTATGTGATAGGCCTCCATTTCTTGAACGATGCTAGTACCTACA TCAAAAGT
[0050] 2?同源性搜尋
[0051]將測(cè)序獲得的序列，在NCBI (http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)上進(jìn)行比 對(duì)，未見(jiàn)相同或者重復(fù)序列，說(shuō)明如它為新的、梔子特有的核苷酸序列，是梔子的SCAR標(biāo)記 (特異性標(biāo)記序列）。
[0052] 實(shí)施例2用本發(fā)明試劑盒特異鑒別梔子
[0053] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0054](一）根據(jù)實(shí)施例1得到的SEQ ID NO. 1所示的序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，合成。
[0055] YZ-A1-1L(SEQ ID NO. 2):5-CCGCTCCTCATTGACTCTTC-3
[0056] YZ-A1-1R(SEQ ID NO. 3):5-TTTCCAGTCTTTTCCGGATG-3
[0057] (二）PCR擴(kuò)增
[0058] 1、為了驗(yàn)證以上引物是梔子品種的特異引物，選取了 6個(gè)水梔子花的DNA和一個(gè) 野生梔子的DNA以及10個(gè)其他品種（金銀花、趕黃草，靈芝，荔枝，桂圓，龍荔，銀杏，當(dāng)歸， 青果，天麻）的植物DNA，DNA提取方法同實(shí)施例1，稀釋成10ng/y1備用。
[0059] 2、PCR擴(kuò)增：
[0060] 1)PCR體系（10 y 1)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。
2. 檢測(cè)SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的試劑在制備梔子檢測(cè)試劑中的用途。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：所述檢測(cè)試劑包括擴(kuò)增SEQIDNO. 1所 示核苷酸序列的試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于：所述擴(kuò)增的試劑包括SEQIDNO. 2~3所 示的引物對(duì)。
5. -種檢測(cè)梔子的試劑盒，其特征在于：包括檢測(cè)SEQIDNO. 1所述核苷酸序列的相 關(guān)試劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑包括擴(kuò)增SEQIDNO. 1所示 核苷酸序列的試劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述擴(kuò)增的試劑包括SEQIDNO. 2~3 所示的引物對(duì)。
8. -種梔子的檢測(cè)方法，其特征在于：包括如下步驟： a，提取樣本DNA:提取待檢樣本中的DNA; b，檢測(cè)：用權(quán)利要求5~7任意一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)待檢樣本，即可。
【專利摘要】本發(fā)明公開了梔子的特異性標(biāo)記序列，還公開了檢測(cè)前述序列的試劑在制備梔子檢測(cè)試劑中的用途，以及梔子的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確、有效的鑒別梔子，特異性強(qiáng)，耗時(shí)短，應(yīng)用前景良好。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104711256
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510030242
【發(fā)明人】梅志強(qiáng), 傅俊江, 成競(jìng)梁
【申請(qǐng)人】瀘州醫(yī)學(xué)院
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年1月21日