玉米花藥特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種玉米花藥特異性啟動(dòng)子及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 高等植物花的結(jié)構(gòu)主要包括：花托、子房、胚珠、萼片、花絲、花瓣、花藥、和花柱等。 花藥是花絲頂端膨大呈囊狀的部分，是雄蕊的重要組成部分，是種子植物的微小孢子堆，成 熟的花藥粒實(shí)為其小配子體，能產(chǎn)生配子?；ㄋ巸?nèi)有花粉囊，其內(nèi)有花粉粒，花粉粒成熟即 可進(jìn)行傳粉，受精，進(jìn)而形成新的個(gè)體。高等植物發(fā)育過程花器官的形成是一個(gè)十分復(fù)雜的 過程，它包括一系列器官分化及嚴(yán)格控制的細(xì)胞及生化變化，同時(shí)伴隨大量基因的協(xié)同表 達(dá)。啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式不同將 其分為組成型、誘導(dǎo)型和組織特異性啟動(dòng)子三類。選擇何種啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)，是當(dāng) 前基因工程研宄的熱點(diǎn)。
[0003] 組織特異性啟動(dòng)子亦稱器官特異性啟動(dòng)子，在這類啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，基因的表達(dá) 往往只限定某些特定的器官和和組織部位，并表現(xiàn)發(fā)育調(diào)節(jié)等特性。組織特異性啟動(dòng)子不 僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累，增加區(qū)域表達(dá)量，同時(shí)也可以避 免植物營養(yǎng)的不必要浪費(fèi)。
[0004] 花藥特異性啟動(dòng)子，可用于外源基因在花藥中的特異表達(dá)，從而避免該外源基因 在植物其他組織中持續(xù)表達(dá)所帶來的不利影響，還可以用于植物花藥生長發(fā)育相關(guān)基因的 功能分析和鑒定；也可以用于花粉敗育實(shí)驗(yàn)中，從而避免由轉(zhuǎn)基因漂移或花粉逃逸所帶來 的生物安全問題，對(duì)植物雄性不育系和恢復(fù)系的創(chuàng)造具有重要意義。
[0005]目前，缺乏一種能夠控制目的基因特異性表達(dá)的玉米花藥特異性啟動(dòng)子及其應(yīng) 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了能夠控制目的基因特異性表達(dá)的玉米花藥 特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供了一種玉米花藥 特異性表達(dá)啟動(dòng)子，其具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。
[0008] 本發(fā)明所述的啟動(dòng)子用于在水稻花藥中特異性表達(dá)目的基因的用途。
[0009] 本發(fā)明含所述的玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。
[0010] 進(jìn)一步地，所述植物表達(dá)載體是用所述玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子取代植物雙元 表達(dá)載體PCAMBIA1301上的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建得到的植物表達(dá)載體。
[0011] 本發(fā)明所述的啟動(dòng)子或所述的植物表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因水稻。
[0013] 本發(fā)明包含所述的啟動(dòng)子、所述的植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞 為根癌農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明一種轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，包括：
[0015] (a)將權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子、或權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì) 胞，
[0016] (b)在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞。
[0017] 進(jìn)一步地，所述植物細(xì)胞為水稻組織細(xì)胞。
[0018] 有益效果：本發(fā)明能在轉(zhuǎn)基因水稻的花藥中特異性表達(dá)，該啟動(dòng)子能夠控制目的 基因特異表達(dá)于花藥，用于外源基因在花藥中的特異表達(dá)，在其他器官組織中不表達(dá)，從而 避免該外源基因在植物其他組織中持續(xù)表達(dá)所帶來的不利影響，如：轉(zhuǎn)基因漂移；花粉逃 逸所帶來的生物安全問題。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] (1)本發(fā)明的玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子為PZmC2H2,其來源于玉米屬玉米Zea maysL.B73自交系，該啟動(dòng)子片段大小為2267bp，所述的啟動(dòng)子具有以下特點(diǎn)（a)位于 GRMZM2G359589基因的5'端及其上游；(b)堿基長度為2267bp;(c)具有引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位 點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)；（d)在玉米的花藥中特異性表達(dá)。
[0020] (2)本發(fā)明的花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子PZmC2H2的重組表達(dá)載體，可以用作花藥特異 表達(dá)基因的啟動(dòng)子，在重組表達(dá)載體的花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子PZmC2H2調(diào)控下使下游基因定 位于花藥表達(dá)，為植物基因工程領(lǐng)域研宄基因在花藥特異表達(dá)提供了工具，具有廣泛的應(yīng) 用前景；本發(fā)明的一種花藥特異性表達(dá)的載體，轉(zhuǎn)入了花藥特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，并在水稻 中進(jìn)行驗(yàn)證。利用前述的玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子取代植物表達(dá)載體PCAMBIA1301上的 CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建成為一個(gè)新的植物表達(dá)載體，命名為pCAM-PZmC2H2。
[0021] (3)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，獲得了 14株轉(zhuǎn)基因植株，PCR檢測有8株陽性 株。并對(duì)陽性植株的的不同組織部位都進(jìn)行了⑶S組織化學(xué)染色。⑶S組織化學(xué)染色鑒定 證實(shí)PZmC2H2啟動(dòng)子為花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子，pCAM-PZmC2H2為一種花特異性表達(dá)的載 體。
【附圖說明】
[0022] 圖lPZmC2H2啟動(dòng)子分子檢測結(jié)果圖；
[0023] 圖2為本發(fā)明的表達(dá)載體PZmC2H2的T-DNA區(qū)圖譜；
[0024] 圖3為本發(fā)明的⑶S基因的組織化學(xué)染色結(jié)果圖；
[0025] 其中：1幼葉；2幼莖；3幼根；4成熟葉；5成熟莖；6成熟根；7穎殼；8花藥；9胚 乳。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明 目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0027] 如圖1至圖3所示，圖1為PZmC2H2啟動(dòng)子分子檢測結(jié)果圖。A為PCR結(jié)果；B為 雙酶切結(jié)果。M:DL-50001:條帶大小為2267bp2 和Bglll雙酶切條帶
[0028] 圖2為本發(fā)明的表達(dá)載體PZmC2H2的T-DNA區(qū)圖譜；LB和RB分別表示為T-DNA的 左邊界和右邊界；Hyg表不潮霉素抗性基因；Mcs表不多克隆位點(diǎn)；Nos表不基因的終止子； BamHI和Bglll分別表示限制性內(nèi)切酶BamHI和Bglll的酶切位點(diǎn)；
[0029] 圖3為本發(fā)明的⑶S基因的組織化學(xué)染色結(jié)果圖；其中：1幼葉；2幼莖；3幼根；4 成熟葉；5成熟莖；6成熟根；7穎殼；8花藥；9胚乳。
[0030] 本發(fā)明提供了一種玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子，其具有SEQIDNO. 1所示的核苷 酸序列。
[0031] 本發(fā)明所述的啟動(dòng)子用于在水稻花藥中特異性表達(dá)目的基因的用途。
[0032] 本發(fā)明含所述的玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。
[0033] 所述植物表達(dá)載體是用所述玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子取代植物雙元表達(dá)載體 PCAMBIA1301上的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建得到的植物表達(dá)載體。
[0034] 本發(fā)明所述的啟動(dòng)子或所述的植物表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0035] 所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因水稻。
[0036] 本發(fā)明包含所述的啟動(dòng)子、所述的植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞 為根癌農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞。
[0037] 本發(fā)明一種轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，包括：
[0038] (a)將權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子、或權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì) 胞，
[0039] (b)在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞。
[0040] 所述植物細(xì)胞為水稻組織細(xì)胞。
[0041] 所用引物均由深圳華大生物工程有限公司合成，上海生工公司測序；pTEAY-Tl、 Taq酶、Trans5a感受態(tài)及相關(guān)的試劑盒購置北京全式金公司；限制性內(nèi)切酶BamHI和 Bglll,T4連接酶購自TaKaRa公司；相應(yīng)的抗生素來自上海生工和SIGMA公司；其余試劑均 為國產(chǎn)分析純。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0042] 實(shí)施例1
[0043] 玉米花藥特異性啟動(dòng)子PZmC2H2的克隆
[0044] 根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的PZmC2H2啟動(dòng)子全長序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增該片段的引物， 上游引物加BamHI的CGGGATCC酶切位點(diǎn)，下游引物加Bglll的GAAGATCT酶切位點(diǎn)。
[0045] 引物序列如下：
[0046] 引物 1(上游引物）：5'-CGGGATCCTACATGGTTCGCATTCGGTT-3?
[0047] 引物 2(下游引物）：5'-GAAGATCTCATCTTCGTGGAGATGAGAG-3'
[0048] 以全式金公司植物基因組試劑盒提取的玉米B73基因組DNA為模板，用上游引物 和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如表1所示：
[0049] 表 1
[0050]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于其具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序 列。
2. 權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子用于在水稻花藥中特異性表達(dá)目的基因的用途。
3. 包含如權(quán)利要求1所述的玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體，其特征在于：所述植物表達(dá)載體是用所述玉 米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子取代植物雙元表達(dá)載體PCAMBIA1301上的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建 得到的植物表達(dá)載體。
5. 權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的 應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因水稻。
7. 包含權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子、權(quán)利要求3或4所述的植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其 中所述宿主細(xì)胞為根癌農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞。
8. -種轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，包括： (a) 將權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子、或權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞， (b) 在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，其特征在于：所述植物細(xì)胞為水稻組 織細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明所述的啟動(dòng)子用于在水稻花藥中特異性表達(dá)目的基因的用途。本發(fā)明包含所述的玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體是用所述玉米花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子取代植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301上的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建得到的植物表達(dá)載體。本發(fā)明能在轉(zhuǎn)基因水稻的花藥中特異性表達(dá)，該啟動(dòng)子能夠控制目的基因特異表達(dá)于花藥，用于外源基因在花藥中的特異表達(dá)，在其他器官組織中不表達(dá)，從而避免該外源基因在植物其他組織中持續(xù)表達(dá)所帶來的不利影響。
【IPC分類】C12N15-84, A01H5-00, C12N1-21, C12N15-113
【公開號(hào)】CN104711262
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510172508
【發(fā)明人】項(xiàng)艷, 吳敏, 董慶, 吳勝男, 江海洋, 蔡榮號(hào), 楊建平
【申請(qǐng)人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年4月13日