關于黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚及其應用，具體設及特異性抑制腫 瘤組織的血管內皮細胞的增殖和遷移，抑制腫瘤血管生成，治療惡性腫瘤的多膚。
【背景技術】
[0002] 1971年化化man提出腫瘤生長和轉移依賴新生血管生成。并認為實體瘤形成后， 其發(fā)展可分為無血管期和血管期兩個階段。無血管期，微小腫瘤的存在依靠周圍間質彌散 供血，生長速度呈線性，腫瘤限制在1mm~2mm之內，瘤細胞數少于10 5~10 6個，迫使腫瘤 處于"休眠狀態(tài)";進入血管期后，腫瘤組織為灌注性供血，瘤體呈指數性生長，2周后可增大 1. 6萬倍。新生血管不僅提供腫瘤所需要的營養(yǎng)和氧氣，排除代謝產物，而且是遠處轉移的 途徑。因此，阻斷腫瘤新生血管形成就可能阻止腫瘤生長和轉移，抗新生血管療法也成為腫 瘤治療的手段之一。
[0003] 血管內皮與基質細胞黏附分子對腫瘤血管生成的作用越來越受到關注。黑色素瘤 細胞粘附分子（melanoma cell a化esion molecule，MCAM)是重要的細胞黏附蛋白，研究報 道黑色素瘤細胞粘附分子是一個新的腫瘤血管標志分子，特異表達在腫瘤新生血管并參與 腫瘤血管生成。黑色素瘤細胞粘附分子具有膜受體的功能，參與VEGF調節(jié)血管生成過程。 研究發(fā)現腫瘤分泌物中的某種因子能夠誘導黑色素瘤細胞粘附分子二聚化，通過P38MAPK 信號通路活化NF- K B，上調多種促血管生成基因（VEGF、比-8、ICAM-1、MMP9)的表達，從而 促進腫瘤血管的生成。動物實驗表明，CD146中和抗體AA98或CD146siRNA都能夠顯著抑 制血管內皮細胞的增殖和遷移，W及多種腫瘤（肝癌、黑色素瘤、肉瘤）的生長和轉移。因 此，抑制黑色素瘤細胞粘附分子可W有效抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長，使腫瘤處 于"休眠狀態(tài)"。
[0004] 目前，沒有成熟開發(fā)的黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚問世，用于治療惡性腫 瘤。
[0005] 本專利中的黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚已證明在治療黑色素瘤中有效，具 有在其他腫瘤模型中開發(fā)的前景。

【發(fā)明內容】

[0006] 發(fā)明目的
[0007] 本發(fā)明提供全新的序列，該序列為黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚，特異性抑 制腫瘤組織的血管內皮細胞的增殖和遷移，對惡性腫瘤具有很好的療效。
[0008] 技術方案
[0009] 黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚，其特征在于其序列為 VAGVPELGLDVELEVT化沈P。
[0010] 所述的黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚在制備治療黑色素瘤藥物中的應用。
[0011] 一種檢測黑色素瘤的試劑盒，其含有所述的黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚。
[0012] 所述的試劑盒，其特征在于還有
[0013] (1)包被液；pH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液；
[0014] (2) PBS緩沖液；pH7. 4的0. 02mol/L磯酸鹽緩沖液；
[00巧]做抗體稀釋液；pHL 4 的 0.〇2mol/LPBS 和 0. 2% BSA ;
[0016] (4)封閉液；pH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0% BSA
[0017] (5)洗漆液；0. 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0. 05% Tween-20 ;
[0018] (6)底物液；可溶性單組份TMB底物溶液；
[0019] (7)終止液；2mol/L硫酸溶液；
[0020] (8)黑色素瘤細胞粘附分子抗體；
[0021] (9)山羊抗小鼠IgG。
[00過有益效果
[0023] 利用固相合成法化學合成黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚，該多膚具有全新的 序列，該多膚可祀向識別腫瘤內皮細胞，并在體外抑制血管內皮細胞的增殖，治療惡性腫 瘤，如黑色素瘤。我們發(fā)現的黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚可W同時抑制血管內皮細 胞遷移活力，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值。也可W作為 檢測試劑盒檢測腫瘤發(fā)生。
【具體實施方式】
[0024] 本發(fā)明設及的多膚由上海生工合成。
[0025] 實施例1
[0026] 黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚人血管內皮細胞遷移的作用。
[0027] 采用劃痕實驗。先用marker筆在24孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每 隔0. 5~1cm -道，橫穿過孔。每孔穿過3條線；將成對數生長的HUVEC細胞，W 1. 0X 1〇5 加入24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2化。第二天用10 y 1槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕，W 劃痕和背后橫線的交叉點為固定觀察位點；實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的 實驗藥物黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚（上海生工合成）和陽性對照藥物長春新堿； 空白組加入相同體積的溶劑，每孔設五個復孔；放入37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，6，12， 24，36小時，拍照；測量0，6，12，24，3化劃痕寬度。W不同的時間點，記錄每孔S個固定位置 處劃痕寬度的變化，即為細胞遷移距離。按照公式計算遷移率（migration rate,MR);遷移 率（MR)=(實驗第n小時的劃痕寬度一實驗第0小時的劃痕寬度）X 100% /實驗第0小時 的劃痕寬度。結果，隨黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚濃度增加，遷移抑制率逐漸下降， 說明黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚能夠抑制人血管內皮細胞遷移，抑制率為87. 2%。 [002引實施例2
[0029] 黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚對體外培養(yǎng)人血管內皮細胞的生長和存活 IC50。
[0030] 采用MTT比色法。將對數生長的人血管內皮細胞HUVEC，W 1. 0X 105加入96孔培 養(yǎng)板中，培養(yǎng)2化，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物黑色素瘤細胞粘 附分子括抗劑多膚（上海生工合成）和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。 每孔設五個復孔，培養(yǎng)4她，分別在化、2h、她、1化、2化、2化、3化、，4她每孔加入MTT，作用化 后，加入DMSO,解育30min，在酶標儀620nm處測定吸光度A值，按公式HUVEC生長抑制率= (1-實驗組吸光值/對照組吸光值）X 100%。計算出實驗藥物的IC50為4. 31 uM。
[00引]實施例3
[0032] 用腫瘤模型檢測黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚的體內活力。
[0033] 建立黑色素瘤腫瘤模型，陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑，實驗 組多膚（上海生工合成）設3個劑量；0. 75、1.5、3mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數量，計 算存活率。結果顯示，黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚可有效地保護小白鼠，提高荷瘤小 鼠的生存率，生存率達到87. 46 %。
[0034] 實施例4含有黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚的化ISA試劑盒檢測：
[0035] 酶連免疫吸附實驗巧LISA)試劑盒包括如下試劑：
[003引 （1)包被液；0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液（P冊.6)。稱取0. 75g碳酸鋼，1. 46g碳酸氨 鋼，加去離子水定容至500ml ;
[0037] (2)PBS緩沖液；0. 02mol/L磯酸鹽緩沖液（pH7. 4)。稱取0. 2g磯酸二氨鐘，2. 90g 磯酸氨二鋼，8g氯化鋼，加去離子水定容到1000ml ;
[0038] (3)抗體稀釋液；0. 02mol/LPBS (pH7. 4)和0. 2% BSA。稱取0. 2濁SA加入配好的 0. 02mol/L磯酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0039] (4)封閉液；0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)和2. 0% BSA。2. 0濁SA加配好的 0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0040] (5)洗漆液；0. 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0. 05 % Tween-20。將 50ulTween-20 溶入 lOOml0.0 2mol/L磯酸鹽緩沖液中，震蕩混勻；
[0041] (6)底物液；可溶性單組份TMB底物溶液；
[0042] (7)終止液；2mol/L硫酸溶液。10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至 100ml，室溫保存；
[0043] (8)黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚
[0044] (9)黑色素瘤細胞粘附分子抗體購自上海一研生物科技有限公司
[004引 （10)二抗（山羊抗小鼠IgG)購自艾美捷科技有限公司
[004引使用方法；1、血清樣本制備：取3只荷瘤裸鼠，進行眼眶取血，每只200化，迅速 離屯、12000巧m 3min，取上清，按體積比1 ;2加PBS，80°C水浴30min，12000巧m 3min取上 清，-20°C凍存?zhèn)溆谩?、黑色素瘤細胞粘附分子抗體為包被抗體，將黑色素瘤細胞粘附分子 抗體溶于包被稀釋液中，濃度為100yg/mL。96孔酶標板每孔加入100y^4°C包被過夜。 棄去包被液，加入封閉液200 y以37°C封閉比。棄去封閉液，分別加入樣品稀釋液稀釋的血 清樣本100 y L(稀釋比1 ;50)和黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚100 y L(l0 y g/ml)及 上述血清樣本50 y L和黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚50 y L的混合物，分成3組，37°C 解育比。棄去血清，PBST和自來水間隔洗漆S次。洗漆后，每孔加入樣品稀釋液稀釋酶標 二抗100化（稀釋比1:10000)，37°C解育比。棄去二抗，洗漆。洗漆后，每孔加入100化 底物液（50yL底物A，50yL底物B)，37°C反應30min后，加入50yL 2M肥S04終止反應， 用酶標儀在450nm波長測定每孔的光密度值0D450nm。結果；黑色素瘤細胞粘附分子括抗 劑多膚可W和黑色素瘤細胞粘附分子抗體結合，并可W競爭血清中黑色素瘤細胞粘附分子 括抗劑，故說明黑色素瘤細胞粘附分子括抗劑多膚用競爭法檢測黑色素瘤細胞粘附分子括 抗劑，實現腫瘤預測；
[0047]
【主權項】
1. 黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽，其特征在于其序列為VAGVPELGLDVELEVTLLSEP。
2. 如權利要求1所述的黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽在制備治療黑色素瘤藥物 中的應用。
3. -種檢測黑色素瘤的試劑盒，其含有權利要求1所述的黑色素瘤細胞粘附分子拮抗 劑多肽。
4. 如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于還有 (1) 包被液：p!19. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液； (2)PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液； (3) 抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS和 0? 2%BSA; (4) 封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0%BSA (5) 洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05%Tween-20 ; (6) 底物液：可溶性單組份TMB底物溶液； (7) 終止液：2mol/L硫酸溶液； (8) 黑色素瘤細胞粘附分子抗體； (9) 山羊抗小鼠IgG。
【專利摘要】關于黑色素瘤細胞粘附分子拮抗劑多肽及其應用。本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及抑制腫瘤血管生成，治療惡性腫瘤的多肽。其序列為VAGVPELGLDVELEVTLLSEP是全新的序列，它們可以在體外特異性抑制腫瘤組織的血管內皮細胞的增殖和遷移，抑制腫瘤血管生成，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值，也可以作為試劑盒檢測腫瘤的發(fā)生。
【IPC分類】A61P35-00, G01N33-68, G01N33-574, C07K14-00, A61K38-16
【公開號】CN104725489
【申請?zhí)枴緾N201510158903
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年4月6日