一種煙草疫霉培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草疫霉培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草黑腔病是由煙草疫霉引起的一種土傳卵菌病 害，是影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害。自然條件下，該病主要由其病原菌煙草疫霉的游動(dòng) 孢子侵染、傳播。為控制該病害，需要對(duì)病原菌煙草疫霉進(jìn)行系統(tǒng)的研宄，其中煙草疫霉的 培養(yǎng)、游動(dòng)孢子的產(chǎn)生與釋放等研宄是一項(xiàng)重要的工作，也是煙草黑脛病抗性鑒定、防治藥 劑篩選、病原菌生物學(xué)特性及病原菌與寄主之間互作等方面研宄中最基礎(chǔ)的。國內(nèi)外的研 宄表明，煙草疫霉的培養(yǎng)、游動(dòng)孢子的產(chǎn)生與釋放與培養(yǎng)條件密切相關(guān)，這些培養(yǎng)條件中， 培養(yǎng)的基質(zhì)即培養(yǎng)基是關(guān)鍵的條件。國外多采用V8培養(yǎng)基，國內(nèi)多采用燕麥培養(yǎng)基，這2 種培養(yǎng)基的生長、產(chǎn)孢潛能往往不能滿足游動(dòng)孢子使用的需要。因此，研發(fā)培養(yǎng)效率更高的 培養(yǎng)基成為當(dāng)務(wù)之急。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種煙草疫霉培養(yǎng)基；第二目的在于提供所述的煙草 疫霉培養(yǎng)基的制備方法。
[0004] 本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，是以植食性物質(zhì)、CaCO3和瓊脂為原料制備 得到，以IOOmL計(jì)，含以植食性物質(zhì)制備得到的汁液80~100mL，CaCO 3 0. 2~0. 4g和瓊脂 I. 7~2. 5g，以水作為培養(yǎng)基調(diào)配劑調(diào)配至額定量，所述的煙草疫霉培養(yǎng)基pH值為6. 8~7. 0。
[0005] 本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括前處理、培養(yǎng)基制備、后處理步驟，具體包 括： A、 前處理：取植食性物質(zhì)去皮切片，加入固液體積比2~5倍的水，搗碎，過濾去渣，濾液 補(bǔ)水至額定量得到植食性物質(zhì)汁液； B、 培養(yǎng)基制備：分別按配方配比取植食性物質(zhì)汁液、CaCO3，調(diào)節(jié)pH值為6. 8~7. 0,加入 配方配比的瓊脂，加熱使完全溶解后得到目標(biāo)培養(yǎng)基； C、 后處理：將目標(biāo)培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，經(jīng)滅菌處理制得成品煙草疫霉培養(yǎng)基。
[0006] 本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草疫霉效果好，菌絲生長速度快、產(chǎn)孢潛能大；培養(yǎng)時(shí)間短 可以節(jié)省培養(yǎng)的時(shí)間和空間、減少污染和培養(yǎng)的能耗，提高了培養(yǎng)的效率；本發(fā)明的制作原 料來源廣泛、成本低廉，制作方法簡單易學(xué)，值得推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0007] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制， 基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0008] 本發(fā)明所述的煙草疫霉培養(yǎng)基，是以植食性物質(zhì)、CaCO3和瓊脂為原料制備得到， 以IOOmL計(jì)，含以植食性物質(zhì)制備得到的汁液80~100mL，CaC0 3 0. 2~0. 4g和瓊脂I. 7~2. 5g， 以水作為培養(yǎng)基調(diào)配劑調(diào)配至額定量，所述的煙草疫霉培養(yǎng)基pH值為6. 8~7. 0。
[0009] 所述的植食性物質(zhì)為南瓜、絲瓜、藕或紅薯，優(yōu)選為南瓜或紅薯。
[0010] 所述的植食性物質(zhì)制備得到的汁液是取20~40g植食性物質(zhì)去皮切片，加入 40~80mL水，搗碎，過濾去渣，濾液補(bǔ)水至IOOmL得到。
[0011] 本發(fā)明所述的煙草疫霉培養(yǎng)基的制備方法，包括前處理、培養(yǎng)基制備、后處理步 驟，具體包括： A、 前處理：取植食性物質(zhì)去皮切片，加入固液體積比2~5倍的水，搗碎，過濾去渣，濾液 補(bǔ)水至額定量得到植食性物質(zhì)汁液； B、 培養(yǎng)基制備：分別按配方配比取植食性物質(zhì)汁液、CaCO3，調(diào)節(jié)pH值為6. 8~7. 0,加入 配方配比的瓊脂，加熱使完全溶解后得到目標(biāo)培養(yǎng)基； C、 后處理：將目標(biāo)培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，經(jīng)滅菌處理制得成品煙草疫霉培養(yǎng)基。
[0012] A步驟中所述的搗碎是米用組織搗碎機(jī)搗碎30~50s。
[0013] A步驟中所述的過濾去渣是采取不少于2層的醫(yī)用紗布或?qū)Ｓ眠^濾材料過濾。
[0014] C步驟中所述的滅菌處理是采取濕熱滅菌、高溫滅菌或蒸汽瞬時(shí)滅菌中的一種。
[0015] C步驟中所述的滅菌處理是采取121°C下高溫滅菌20~40min。
[0016] 本發(fā)明所述的煙草疫霉培養(yǎng)基的制備方法，具體操作如下： A、 將20~40g植食性物質(zhì)去皮切片，加入IOOmL水中，搗碎，過濾去渣，補(bǔ)足水定容至 100mL，混勻，即得到IOOmL植食性物質(zhì)搗碎液； B、 在步驟A的植食性物質(zhì)搗碎液中加入CaCO3 0. 2~0. 4g、瓊脂I. 7~2. 5g，121°C滅菌 15~30分鐘，冷卻至50~60 °C，搖勻，倒平板。
[0017] 實(shí)施例1 1、材料與方法 1. 1材料 1. 1. 1供試菌種 煙草疫霉0號(hào)生理小種Pn 119菌株。
[0018] I. L 2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基：燕麥培養(yǎng)基、10% V8培養(yǎng)基、南瓜培養(yǎng)基、絲瓜培養(yǎng)基、藕培養(yǎng)基、紅薯培養(yǎng)基。
[0019] 1.2 方法 1. 2. 1培養(yǎng)基的制備 南瓜培養(yǎng)基：將20~40g南瓜洗凈去皮、切成小片，加去離子水50mL，用組織搗碎機(jī)搗碎 約40s，2層紗布過濾去渣，補(bǔ)足水至100mL，加入瓊脂2g、CaCO3 0. 4g。其余培養(yǎng)基的制備 同南瓜培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基在加入瓊脂前，調(diào)節(jié)其pH，使培養(yǎng)基的pH保持在6. 8~7. 0之間。
[0020] 制備好的培養(yǎng)基分裝250mL三角瓶121°C、20min滅菌，待培養(yǎng)基溫度降至50°C左 右，在超凈工作臺(tái)上將培養(yǎng)基倒入直徑9cm滅菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿20mL培養(yǎng)基，冷卻備 用。
[0021] 1.2.2生長培養(yǎng)基選擇 煙草疫霉在燕麥培養(yǎng)基平板上活化2~3次，28°C黑暗培養(yǎng)7~10天，用打孔器按同心圓 環(huán)打取直徑5mm的菌絲塊，鑷子移取一塊菌絲面貼接至各供試培養(yǎng)基平板上。每種培養(yǎng)基5 個(gè)平板即5次重復(fù)，28°C黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)第3、5天測(cè)量日生長速度，記錄菌絲量(菌絲薄厚 疏密)、長滿平板的天數(shù)。
[0022] 1. 2. 3產(chǎn)孢能力測(cè)定 供試培養(yǎng)基接種培養(yǎng)10天后，打孔器打取直徑5mm菌絲塊15塊于滅菌空培養(yǎng)皿中，采 用菌絲叢水培法誘導(dǎo)誘導(dǎo)孢子囊、變溫釋放游動(dòng)孢子、計(jì)數(shù)游動(dòng)孢子數(shù)。
[0023] 2、結(jié)果與分析 2. 1生長培養(yǎng)基的選擇 在供試的6種培養(yǎng)基中，所有的培養(yǎng)基均能生長，菌落顏色均為純白色，但菌絲生長速 度存在明顯差別，生長速度最快的是紅薯培養(yǎng)基、南瓜培養(yǎng)基，其次是燕麥培養(yǎng)基，再次是 絲瓜培養(yǎng)基、藕培養(yǎng)基，最次的是10% V8培養(yǎng)基(表1)。從長滿平板的時(shí)間看，10% V8培養(yǎng) 基比其他培養(yǎng)基晚3天，而其他6天就可以長滿平板。
[0024] 表1煙草疫霉在不同培養(yǎng)基上的生長情況
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種煙草疫霉培養(yǎng)基，其特征在于所述的煙草疫霉培養(yǎng)基是以植食性物質(zhì)、CaCO3 和瓊脂為原料制備得到，以IOOmL計(jì)，含以植食性物質(zhì)制備得到的汁液80~100mL，CaCO3 0. 2~0. 4g和瓊脂I. 7~2. 5g，以水作為培養(yǎng)基調(diào)配劑調(diào)配至額定量，所述的煙草疫霉培養(yǎng)基 pH值為 6. 8~7. 0。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草疫霉培養(yǎng)基，其特征在于所述的植食性物質(zhì)為南瓜、絲 瓜、藕或紅薯，優(yōu)選為南瓜或紅薯。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草疫霉培養(yǎng)基，其特征在于所述的植食性物質(zhì)制備得到的 汁液是取20~40g植食性物質(zhì)去皮切片，加入40~80mL水，搗碎，過濾去渣，濾液補(bǔ)水至IOOmL 得到。
4. 一種權(quán)利要求1~3任一所述的煙草疫霉培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括前處 理、培養(yǎng)基制備、后處理步驟，具體包括： A、 前處理：取植食性物質(zhì)去皮切片，加入固液體積比2~5倍的水，搗碎，過濾去渣，濾液 補(bǔ)水至額定量得到植食性物質(zhì)汁液； B、 培養(yǎng)基制備：分別按配方配比取植食性物質(zhì)汁液、CaCO3，調(diào)節(jié)pH值為6. 8~7. 0,加入 配方配比的瓊脂，加熱使完全溶解后得到目標(biāo)培養(yǎng)基； C、 后處理：將目標(biāo)培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，經(jīng)滅菌處理制得成品煙草疫霉培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于A步驟中所述的搗碎是采用組織搗碎 機(jī)搗碎30~50s。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于A步驟中所述的過濾去渣是采取不少 于2層的醫(yī)用紗布或?qū)Ｓ眠^濾材料過濾。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于C步驟中所述的滅菌處理是采取濕熱 滅菌、高溫滅菌或蒸汽瞬時(shí)滅菌中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4或7所述的制備方法，其特征在于C步驟中所述的滅菌處理是采取 121°C下高溫滅菌20~40min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草疫霉培養(yǎng)基及其制備方法，所述煙草疫霉培養(yǎng)基是以植食性物質(zhì)、CaCO3和瓊脂為原料制備得到，以100mL計(jì)，含以植食性物質(zhì)制備得到的汁液80~100mL，CaCO3 0.2~0.4g和瓊脂1.7~2.5g，以水作為培養(yǎng)基調(diào)配劑調(diào)配至額定量，煙草疫霉培養(yǎng)基pH值為6.8~7.0。所述制備方法，包括前處理、培養(yǎng)基制備、后處理步驟，具體是將20~40g南瓜（絲瓜、藕或紅薯）切片，加入100mL水中，搗碎，過濾去渣，補(bǔ)足水至100mL，加入CaCO3 0.2~0.4g、瓊脂1.7~2.5g滅菌即得。本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草疫霉效果好，菌絲生長速度快、產(chǎn)孢潛能大；培養(yǎng)時(shí)間短可以節(jié)省培養(yǎng)的時(shí)間和空間、減少污染和培養(yǎng)的能耗，提高了培養(yǎng)的效率；本發(fā)明的制作原料來源廣泛、成本低廉，制作方法簡單易學(xué)，值得推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12N1-14, C12R1-645
【公開號(hào)】CN104726349
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510174981
【發(fā)明人】方敦煌, 陳學(xué)軍, 肖炳光, 吳興富, 張誼寒
【申請(qǐng)人】云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年4月15日