血清3型鴨甲型肝炎病毒活疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種血清3型鴨甲型肝炎活疫苗（DHAV-3)及其制備方法，屬于獸用生 物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus, DHAV)屬微RNA病毒科成員（陸承 平.獸醫(yī)微生物學(xué).（第五版）北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012, 460-466.)，是引致雛鴨肝炎 的最重要病原，主要感染4周齡以下的雛鴨發(fā)生以肝臟出血為特征的急性肝炎，發(fā)病急、傳 播快、發(fā)病率和死亡率可達90%以上。由DHAV引起的鴨肝炎自上世紀五十年代在美國被 發(fā)現(xiàn)以后，迅速在世界養(yǎng)鴨地區(qū)爆發(fā)和蔓延，我國黃均建（黃均建.小鴨病毒性肝炎研宄， 上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研宄所單行本，1963.) 1963年首次報道了上海地區(qū)鴨場爆發(fā)此 病，王平等（王平等.北京小鴨病毒性肝炎的研宄.北京大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1980， I :55) 1980年首先在北京地區(qū)發(fā)病鴨場分離到病毒，之后我國養(yǎng)鴨地區(qū)均有本病的發(fā)生和 流行。隨著近幾年來鴨肝炎弱毒活疫苗和高免卵黃抗體的研制成功及臨床應(yīng)用，使本病在 很大程度上得到很好的控制。
[0003] 1992年 Sandhu等（Sandhu，T. S.，B. W. Calnek，and L. Zeman. 1992. Pathologic and serologic characterization of a variant of duck hepatitis type I virus. Avian Dis 36:932-936.)報道鴨肝炎病毒發(fā)生變異現(xiàn)象，2002年蘇敬良等（蘇敬良等.新型鴨 肝炎病毒的分離及初步鑒定.中國獸醫(yī)科技，2002, 1:15-16.)報道北京和廣西等地區(qū)免 疫過鴨肝炎疫苗或注射過鴨肝炎高免卵黃抗體的鴨群仍然發(fā)生鴨肝炎，并且證明分離到的 鴨肝炎病毒與經(jīng)典的鴨肝炎病毒無血清學(xué)交叉反應(yīng)，故暫稱新型鴨肝炎病毒。2007年，臺 灣學(xué)者 Tseng (Tseng C. H.，Tsai H. J. , Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus. Virus Res, 2007, 126:19-31.)和韓國學(xué)者Kim(Kim M.C·，Kwon Y. K. ,Joh S.J. , et al. Recent Korean isolates of duck hepatitis virus revealed the presence of a new geno-and serotype when compared to duck hepatitis virus typel type strains. Arch Virol. 2007, I 52:2059-2072.)分別報道分離到不同于經(jīng)典的鴨肝炎 病毒的新型鴨肝炎病毒，通過分子生物學(xué)和血清學(xué)鑒定，表明臺灣和韓國分離的新型鴨肝 炎病毒均屬DHAV，但它們之間也存在著明顯的血清學(xué)差異，所以現(xiàn)在已明確將DHAV分為3 個血清型 [1]，并將經(jīng)典的鴨肝炎病毒、臺灣新型鴨肝炎病毒和韓國新型鴨肝炎病毒分別歸 屬到血清1型鴨甲型肝炎病毒（DHAV-I)、血清2型鴨甲型肝炎病毒（DHAV-2)和血清3型鴨 甲型肝炎病毒（DHAV-3)之中。通過分子生物學(xué)鑒定和血清學(xué)試驗證實，我國大陸自2002 年以來分離鑒定的所有新型鴨肝炎病毒株與韓國新型鴨肝炎病毒高度同源，均為血清3型 鴨甲型肝炎病毒（DHAV-3)。
[0004] 眾所周知，我國是養(yǎng)鴨大國，目前鴨的年飼養(yǎng)量已達40億只，占全世界鴨飼養(yǎng)總 量的70%以上，鴨肝炎一直是我國養(yǎng)鴨生產(chǎn)的頭號疫病，近年來隨著血清1型鴨甲型肝炎 活疫苗和高免卵黃抗體的推廣應(yīng)用，使血清1型鴨甲型肝炎得到有效控制，但近十年來由 于新出現(xiàn)血清3型鴨甲型肝炎在我國養(yǎng)鴨地區(qū)爆發(fā)和迅速蔓延，又成為制約我國養(yǎng)鴨生產(chǎn) 新的嚴峻問題。因此，血清3型鴨甲型肝炎病毒（DHAV-3)弱毒株的培育和活疫苗的研制， 以及針血清1型和血清3型鴨甲型肝炎二價活疫苗的研制成為當務(wù)之急。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種血清3型鴨甲型肝炎病毒（DHAV-3)的弱毒株及其單 價活疫苗和血清1型與血清3型二價活疫苗的制備方法。
[0006] 本發(fā)明可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] 1. 一種血清3型鴨甲型肝炎病毒（DHAV-3)弱毒HuB60株，該毒株已于2015年01 月06日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研宄所中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC No. 10307。
[0008] 2.如權(quán)利要求1所述血清3型鴨甲型肝炎病毒（DHAV-3) HuB60株是通過雞胚傳代 培養(yǎng)獲得的弱毒株。
[0009] 3.如權(quán)利要求2所述DHAV-3的雞胚培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0010] (1)選取經(jīng)抗DHAV-I陽性血清和抗DHAV-3陽性血清在鴨胚上進行中和試驗和交 叉中和試驗確診為DHAV-3的肝臟組織病料用于雞胚培養(yǎng)分離病毒；
[0011] (2)DHAV-3的組織病料的處理：取少許DHAV-3的肝臟組織，用滅菌生理鹽水做 1:5 (W/V)左右稀釋、研磨、凍融2~3次、離心，取離心上清液經(jīng)0. 22 μ m濾器除菌過濾；
[0012] (3)雞胚接種分離病毒：取上述無菌濾液通過卵黃囊接種途徑接種6~8日齡SPF 雞胚，每只胚接種0. 2~0. 5ml，37°C培養(yǎng)，24h內(nèi)死胚棄之，連續(xù)觀察至120h，其間若有雞胚 死亡，隨時取出置2~8°C冰箱冷藏數(shù)小時或過夜；若無死亡，則于72~96h隨機取3枚胚 置2~8°C冷藏過夜；
[0013] (4)雞胚傳代接種：及時取出胚體，研磨成勻漿、離心取上清液經(jīng)0. 22 μm除菌過 濾，取濾液經(jīng)卵黃囊接種6~8日齡SPF雞胚5~10枚，每只胚0. 2~0. 5ml ;盲傳5~10 代，隨著傳代次數(shù)的增加，雞胚死亡時間前移，雞胚死亡率也逐漸達到100%，表明通過雞胚 分離病毒成功，并逐漸適應(yīng)雞胚培養(yǎng)。
[0014] 4. -種疫苗組合物，其特征在于包含活的如權(quán)利要求1所述的DHAV-3弱毒株（如 HuB60株）和獸用生物制品可接受的凍干保護劑。
[0015] 5. -種疫苗組合物，其特征在于包含活的如權(quán)利要求1所述的DHAV-3弱毒株（如 HuB60株）、DHAV-I弱毒株（如A66株）和獸用生物制品可接受的凍干保護劑。
[0016] 6.如權(quán)利要求3所述DHAV-I弱毒株（A66株），該毒株已于2013年08月13日送 交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 8020。
[0017] 本發(fā)明的詳細描述：
[0018] 一、生產(chǎn)毒株血清3型鴨甲型肝炎病毒（DHAV-3)HuB60株的培育
[0019] ( -）病料的選擇
[0020] 對湖北某鴨場臨床發(fā)生典型鴨肝炎癥狀的5日齡病死鴨，無菌操作取肝臟組織經(jīng) 實驗室鑒定：
[0021] I. RT-PCR檢測：取肝組織樣品提取RNA，經(jīng)PCR擴增和電泳，出現(xiàn)血清3型鴨甲型 肝炎病毒特異性條帶；
[0022] 2.病毒分離：取少許肝臟組織，用每毫升含青、鏈霉素各1000單位的滅菌生理鹽 水做I : 10(W/V)稀釋、研磨、凍融2次、3000r/min離心10min，取離心上清液經(jīng)0. 22 μπι濾 器去菌過濾，取該濾液通過尿囊腔途徑接種11日齡敏感鴨胚5只，每只胚接種0. 2ml，37°C 溫箱培養(yǎng)，于接種后48~96h鴨胚全部死亡。
[0023] 3.血清中和試驗鑒定：取死亡鴨胚尿囊液100倍稀釋，與等量抗DHAV-I陽性血清 和抗DHAV-3陽性血清作用Ih后，在鴨胚上進行血清中和試驗和交叉中和試驗，見表1。實 驗室檢測結(jié)果表明，湖北孝感某鴨場臨床發(fā)生的鴨肝炎為DHAV-3所致。
[0024] 表1血清中和試驗和交叉中和試驗結(jié)果
[0025]
【主權(quán)項】
1. 一種血清3型鴨甲型肝炎病毒（duckhepatitisAvirus,DHAV-3)弱毒HuB60株， 該毒株已于2015年Ol月06日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物 研宄所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCCNo. 10307。
2. 如權(quán)利要求1所述血清3型鴨甲型肝炎病毒DHAV-3HuB60株（CGMCCNo. 10307株） 是通過雞胚傳代培養(yǎng)獲得的弱毒株。
3. 如權(quán)利要求2所述DHAV-3的雞胚培養(yǎng)方法，包括以下步驟： (1) 選取經(jīng)抗DHAV-I陽性血清和抗DHAV-3陽性血清在鴨胚上進行中和試驗和交叉中 和試驗，確診為DHAV-3感染的肝臟組織病料用于雞胚培養(yǎng)分離病毒； (2)DHAV-3的組織病料的處理：取少許DHAV-3的肝臟組織，用滅菌生理鹽水做1:5(W/ V)左右稀釋、研磨、凍融2~3次、離心，取離心上清液經(jīng)0. 22ym濾器除菌過濾； (3) 雞胚接種分離病毒：取上述無菌濾液通過卵黃囊接種途徑接種6~8日齡SPF雞 胚，每只胚接種0. 2~0. 5ml，37°C培養(yǎng)，24h內(nèi)死胚棄之，連續(xù)觀察至120h，其間若有雞胚死 亡，隨時取出置2~8°C冰箱冷藏數(shù)小時或過夜；若無死亡，則于72~96h隨機取3枚胚置 2~8°C冷藏過夜； (4) 雞胚傳代培養(yǎng)：及時取出胚體，研磨成勻漿、離心取上清液經(jīng)0. 22ym除菌過濾，取 濾液經(jīng)卵黃囊接種6~8日齡SPF雞胚5~10枚，每只胚0. 2~0. 5ml;盲傳5~10代， 隨著傳代次數(shù)的增加，雞胚死亡時間前移，雞胚死亡率也逐漸達到1〇〇 %，表明通過雞胚分 離病毒成功，并逐漸適應(yīng)雞胚培養(yǎng)。
4. 一種疫苗組合物，其特征在于包含活的如權(quán)利要求1所述的DHAV-3弱毒株（如 HuB60株，S卩CGMCCNo.10307株）和獸用生物制品可接受的凍干保護劑。
5. -種疫苗組合物，其特征在于包含活的如權(quán)利要求1所述的DHAV-3弱毒株（如 HuB60株，S卩CGMCCNo. 10307株）、DHAV-I弱毒株（如A66株）和獸用生物制品可接受的 凍干保護劑。
6. 如權(quán)利要求3所述DHAV-I弱毒株A66株，該毒株已于2013年08月13日送交北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo. 8020。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種血清3型鴨甲型肝炎(DHAV-3)活疫苗及其制備方法。目前血清3型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-3)一般只能通過鴨胚進行分離和培養(yǎng)，這對于該病毒的研究和血清3型鴨肝炎活疫苗的研制造成很大的障礙。本發(fā)明采用雞胚卵黃囊接種途徑，由患鴨肝炎病鴨肝臟組織分離獲得血清3型鴨甲型肝炎病毒，并通過雞胚連續(xù)傳代培育得到一株致弱毒株HuB60株(CGMCC No.10307)，該致弱毒株可用于制備血清3型鴨甲型肝炎(DHAV-3)活疫苗，也可以與血清1型鴨甲型肝炎弱毒株(如A66株)以適易比例混合制備鴨甲型肝炎二價活疫苗。CGMCC No.1030720150106
【IPC分類】C12R1-93, C12N7-08, A61K39-125, A61P31-14, C12N7-00
【公開號】CN104726414
【申請?zhí)枴緾N201510006646
【發(fā)明人】張小飛, 盧鳳英, 丁美娟, 黃顯明, 李華東
【申請人】南京天邦生物科技有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年1月7日