糖脂質(zhì)的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及新型醇氧化酶以及編碼該醇氧化酶的基因。另外，本發(fā)明涉及使該醇 氧化酶缺失等而得到的轉(zhuǎn)化體以及使用該轉(zhuǎn)化體的糖脂質(zhì)的制造方法。
【背景技術】
[0002] 作為糖脂質(zhì)的一種的烷基葡萄糖苷或者槐糖脂（sophorose lipid)是作為表面活 性劑而配合于各種洗滌劑等中。
[0003] 烷基葡萄糖苷或者槐糖脂的工業(yè)生產(chǎn)主要是以糖和醇作為原料通過化學合成來 進行，但是存在需要大量原料醇，并且由于進行高溫?高壓下的反應而原料葡萄糖會改性等 的問題。
[0004] 從這樣的實際情況出發(fā)，尋求更高效率的生產(chǎn)方法，探討了使用微生物的糖脂質(zhì) 的制造技術。例如，已知如果在含有糖和醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)作為酵母的1種的假絲酵母菌 (Candida bombicola),則作為產(chǎn)物可以得到烷基槐糖苷(alkyl sophoroside)或者槐糖脂 (參照專利文獻1和非專利文獻1)。
[0005] 現(xiàn)有技術文獻
[0006] 專利文獻1 :美國專利第6433152號說明書
[0007] 非專利文獻 I 〖Biotechnology Letters, Volume 20, No. 3, 1998, PP. 215-218

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 然而，使用上述微生物的制造方法雖然能夠進行常溫?常壓下的糖脂質(zhì)制造，但是 存在糖脂質(zhì)相對于原料醇的收率非常低的問題。
[0009] 在此，本發(fā)明的課題在于，提供在常溫?常壓下能夠生產(chǎn)率良好地制造糖脂質(zhì)的微 生物轉(zhuǎn)化體、以及使用該轉(zhuǎn)化體的糖脂質(zhì)的制造方法。
[0010] 本發(fā)明者們針對使用微生物的糖脂質(zhì)的制造技術進行了專門探討，結果發(fā)現(xiàn)：在 假絲酵母菌(Candida bomb i col a)的醇代謝路徑中，有新型的醇氧化酶參與。進一步發(fā)現(xiàn)， 用使該醇氧化酶基因的功能降低的轉(zhuǎn)化體會顯著提高糖脂質(zhì)的生產(chǎn)率。本發(fā)明是基于這些 發(fā)現(xiàn)完成的。
[0011] 即，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化體（以下也稱為"本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體"），其在具有編碼下述 (a)~（c)中任一種蛋白質(zhì)的基因的宿主中，該基因缺失、變異或者表達抑制，并且與該宿 主相比醇氧化酶活性降低。
[0012] (a)由序列號1所表示的氨基酸序列構成的蛋白質(zhì)；
[0013] (b)由與序列號1所表示的氨基酸序列具有50%以上的同一性的氨基酸序列構 成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)；
[0014] (c)由在序列號1所表示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、置換、插入、或者 附加而成的氨基酸序列構成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
[0015] 另外，本發(fā)明涉及包括下述（1)和（2)的工序的糖脂質(zhì)的制造方法（以下也稱為 "本發(fā)明的糖脂質(zhì)的制造方法"）。
[0016] (1)在含有醇和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體的工序；以及
[0017] (2)從所得到的培養(yǎng)物中采集糖脂質(zhì)的工序。
[0018] 另外，本發(fā)明涉及編碼上述（a)~（c)中任一種蛋白質(zhì)的基因（以下也稱為"本發(fā) 明的基因"）。
[0019] 另外，本發(fā)明涉及上述（a)~（c)中任一種蛋白質(zhì)（以下也稱為"本發(fā)明的蛋白 質(zhì)"）。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，可以提供對糖脂質(zhì)的高效生產(chǎn)有用的新型醇氧化酶以及編碼該醇氧 化酶的基因。另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供糖脂質(zhì)的生產(chǎn)能優(yōu)異的轉(zhuǎn)化體。進一步，根據(jù)本 發(fā)明，可以提供生產(chǎn)率優(yōu)異且對糖脂質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)有用的糖脂質(zhì)的制造方法。
[0021] 本發(fā)明的上述以及其它特征和優(yōu)點通過參照適當?shù)母綀D，從下述的記載更明確。
【附圖說明】
[0022] [圖1]是將實施例中制作的KSM36株、NBRC10243株、KSMAura3株中ura3基閔 區(qū)域的序列的一部分進行比較的圖。
[0023] [圖2]是表示將實施例中制作的KSM Δ ura-ura株和KSM Δ AOX株改變碳源進行培 養(yǎng)，每段培養(yǎng)時間的活菌數(shù)的圖。
[0024] [圖3]是表示在實施例中制作的KSM Δ ura-ura株和KSM Δ AOX株中醇氧化酶活性 的圖。
[0025] [圖4]是表示在實施例中制作的BL21 (DE3)-pET-AOX株和BL21 (DE3)-pET株中， 表達蛋白質(zhì)的檢測結果的圖。
[0026] [圖5]是表示在BL21 (DE3)-pET-AOX株和BL21 (DE3)-pET株中醇氧化酶活性的 圖。
[0027] [圖6]是表示將在實施例中制作的KSMA ura-ura株和KSMAAOX株用1-十四醇 作為基質(zhì)進行培養(yǎng)的培養(yǎng)液的GC分析結果的圖。
【具體實施方式】
[0028] 1.醇氧化酶
[0029] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)是以下的（a)~（c)中任一種蛋白質(zhì)（以下也稱為"本發(fā)明的醇 氧化酶"）。
[0030] (a)由序列號1所表示的氨基酸序列構成的蛋白質(zhì)；
[0031] (b)由與序列號1所表示的氨基酸序列具有50%以上的同一性的氨基酸序列構 成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)；
[0032] (c)由在序列號1所表示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、置換、插入、或者 附加而成的氨基酸序列構成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
[0033] 由上述（a)的序列號1所表示的氨基酸序列構成的蛋白質(zhì)是來自假絲酵母菌 (Candida bomb i col a)的新型醇氧化酶。
[0034] 在微生物的醇氧化酶中，有醇氧化酶（alcohol oxidase)(以下，也簡記為"A0X"） 或醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase) (ADH)，并且催化將醇氧化為醛的反應。對于假絲酵 母菌(Candida bomb i col a)的醇氧化酶，至今沒有詳細了解，本次由本發(fā)明者們首次鑒定 了醇氧化酶及其基因。該蛋白質(zhì)如后述的實施例所示，具有醇氧化酶活性。將假絲酵母菌 (Candida bombicola)的醇氧化酶的氨基酸序列示于序列號1中，將基因的堿基序列示于 序列號2中。
[0035] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，在上述（a)的蛋白質(zhì)之外，作為與該蛋白質(zhì)功能均等的蛋白 質(zhì)包含上述（b)和（C)的蛋白質(zhì)。
[0036] 在上述（b)中，氨基酸序列的同一性從糖脂質(zhì)的生產(chǎn)率提高的觀點出發(fā)，優(yōu)選為 80%以上，進一步優(yōu)選為90%以上，更加優(yōu)選為95%以上。
[0037] 在本發(fā)明中，氨基酸序列的同一性是指將比較的2個氨基酸序列根據(jù)需要導入 間隙來進行排列（比對（alignment))，所得到的最大的氨基酸序列的同一性（％ )。氨基 酸序列的同一性可以通過通常的方法進行分析，例如可以通過安裝有BLAST算法的NCBI BLAST (http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/)的 blastp 或者安裝有Genetyx Win 的 Homology search等來計算。
[0038] 另外，上述（c)中，從糖脂質(zhì)的生產(chǎn)率提高的觀點出發(fā)，"1個或者多個氨基酸"優(yōu) 選為1~10個氨基酸，進一步優(yōu)選為1~5個氨基酸，更加優(yōu)選為1~3個氨基酸。
[0039] 另外，這些蛋白質(zhì)具有醇氧化酶活性，這可以通過破壞編碼該蛋白質(zhì)的基因來測 定菌體內(nèi)的醇氧化酶活性的方法、或者用大腸桿菌等生產(chǎn)該蛋白質(zhì)，并且測定該醇氧化酶 活性的方法等來確認。在醇氧化酶活性的測定中，可以使用在后述的實施例中使用的方法 等。
[0040] 對于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的獲取方法不特別限定，可以通過通常進行的化學或者基因 工程的方法等來獲得。例如，可以通過從假絲酵母菌(Candida bombicola)等的微生物中 分離、精制等獲得來自天然產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。另外，還可以基于序列號1所示的氨基酸序列信 息進行人工合成等，也可以通過化學合成來進行蛋白質(zhì)合成，也可以通過基因重組技術制 作重組蛋白質(zhì)。在制作重組蛋白質(zhì)的情況下，可以使用后述的本發(fā)明的醇氧化酶基因。
[0041] 2.醇氧化酶基因
[0042] 本發(fā)明的基因是編碼上述（a)~（c)中任一種蛋白質(zhì)的基因（以下也稱為"本發(fā) 明的醇氧化酶基因"）。
[0043] 作為編碼上述（a)~（c)中任一種蛋白質(zhì)的基因的具體例子，可以列舉由下述 (d)~（f)中任一種DNA構成的基因。
[0044] (d)由序列號2所表示的堿基序列構成的DNA ;
[0045] (e)由與序列號2所表不的喊基序列具有50%以上的同一性的喊基序列構成，并 且編碼具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ;
[0046] (f)與由序列號2所表示的堿基序列互補的堿基序列構成的DNA在嚴格的條件 (stringent condition)下進行雜交的DNA，并且編碼具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
[0047] 在上述（e)中，從糖脂質(zhì)的生產(chǎn)率提高的觀點出發(fā)，堿基序列的同一性優(yōu)選為 80%以上，進一步優(yōu)選為90%以上，更加優(yōu)選為95%以上。
[0048] 在本發(fā)明中，堿基序列的同一性是指將比較的2個堿基序列根據(jù)需要導入間隙來 進行排列（比對），所得到的最大的堿基序列的同一性（％)。堿基序列的同一性可以通過通 常的方法進行分析，例如可以通過安裝有BLAST算法的NCBI BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/)的 blastp 或者安裝有 Genetyx Win 的 Homology search 等來計算。
[0049] 另外，在上述（f)中，作為"嚴格的條件"，可以列舉Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITI0N[Joseph Sambrook，David W. Russell.，美國冷泉港實 驗室出版社]中記載的Southern雜交法等，例如可以列舉在含有6 X SSC (I X SSC的組成 為：0· 15M氯化鈉 ，(λ 015M檸檬酸鈉，ρΗ7· 0)、0· 5% SDS、5XDenhardt 溶液以及 100mg/mL鯡 魚精子DNA的溶液中，以探針且在42°C下恒溫8~16小時使雜交進行的條件。
[0050] 作為本發(fā)明的醇氧化酶基因的獲取方法，不特別限定，可以通過通常的基因工程 的方法獲得。例如，可以基于序列號1所示的氨基酸序列或者序列號2所示的堿基序列， 通過人工合成獲得本發(fā)明的醇氧化酶基因?；虻娜斯ず铣衫缈梢岳肐nvitrogen公 司等的服務。另外，也可以通過從假絲酵母菌(Candida bomb i col a)等的微生物克隆來 獲得，例如，可以通過 Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITI0N[Jos印h Sambrook，David W. Russell，美國冷泉港實驗室出版社（2001)]中記載的方法等來進行。
[0051] 在序列號1所示的氨基酸序列或者序列號2所表示的堿基序列中導入變異的 情況下，例如可以列舉部位特異性變異導入法。作為