傳統(tǒng)育種技術(shù)也可以與本發(fā)明組合，從而有力地組合、漸滲、 和改進性狀選擇。
[0090] 提供本文中引用和討論的所有參考文獻（包括出版物、專利、和專利申請）僅僅是 因為它們的公開早于本申請的提交日。本文中無一處解釋為承認發(fā)明人沒有權(quán)利憑借發(fā)明 在先而早于此類公開。 實施例
[0091] 提供下面的實施例來例示某些特定特征和/或方面。這些實施例不應(yīng)解釋為將公 開限制于所描述的特定特征或方面。
[0092] 實施例1 :自細菌人工染色體文庫鑒定旁系同源FAD2和FAD3靶序列
[0093] BAC 構(gòu)律
[0094] 細菌人工染色體（BAC)文庫購自供應(yīng)商（Amplicon Express，Pullman，WA)。BAC 文庫由110, 592個BAC克隆組成，其含有自油菜變種DH10275分離的高分子量基因組 DNA(gDNA)片段。用BamHI或HindIII限制酶消化gDNA。將分離的約135Kbp的gDNA片段連 接入 pCCIBAC 載體（Epicentre，Madison，WI)，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株 DHlOB (Invitrogen) 〇 BAC文庫由用兩種不同限制酶構(gòu)建的偶數(shù)個BAC克隆構(gòu)成。因此，HindIII構(gòu)建的BAC文庫 由144塊384孔板組成。同樣地，BamHI構(gòu)建的BAC文庫由144塊384孔板組成。分離了總 共110, 592個BAC克隆，并排列入288塊384孔板。288塊384孔板中的每一個都由供應(yīng)商 以單一 DNA提取提供，用于基于PCR的快速篩選。產(chǎn)生的BAC文庫覆蓋大約15Gbp gDNA，相 當(dāng)于油菜變種DH10275基因組的12倍基因組覆蓋（如Johnston et al. (2005) Annals of Botany 95:229-235中所述，油菜基因組估值為約I. 132Gbp)。
[0095] 自BAC f庫分離的FAD2編碼序列的序列分析
[0096] 用構(gòu)建的BAC文庫分離FAD2基因編碼序列。進行測序?qū)嶒炓澡b定來自油菜變種 DH10275的四種FAD2基因旁系同源物的具體基因序列。
[0097] FAD2基因序列最初是在模型物種擬南芥內(nèi)鑒定的。基因序列在Genbank中列 為基因座標(biāo)簽:At3gl2120。先前描述了模型植物物種擬南芥和二倍體蕪菁（四倍體油菜 的祖先之一）之間的比較基因組關(guān)系（Schranz et al. (2006)Trends in Plant Science 11 (11) :535-542)。具體關(guān)于FAD2基因，比較分析預(yù)測在二倍體蕓苔基因組內(nèi)可存在基因 的 3-4個拷貝。另外的遺傳作圖研宄由 Scheffler et al. (1997) Theoretical and Applied Genetics 94:583-591完成。這些遺傳作圖研宄的結(jié)果顯示在油菜中存在FAD2基因的4個 拷貝。
[0098] 自油菜變種DH12075構(gòu)建的BAC文庫的測序分析導(dǎo)致了四種BAC序列的分離（SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3,和 SEQ ID N0:4)，由此確定了 FAD2A(SEQ ID N0:5)， FAD2-1(SEQIDN0:6)，F(xiàn)AD2-2(SEQIDN0:7)，和FAD2-3(SEQIDN0:8)基因的編碼序列。 鑒定FAD2A，F(xiàn)AD2-1，F(xiàn)AD2-2,和FAD2-3基因序列并進行遺傳作圖。使用序列比對程序和 利用同一性百分比的鄰居連接樹進行四種FAD2基因的序列分析。經(jīng)由來自Vector NTI Advance 11.0 計算機程序（Life Technologies，Carlsbad，CA)的ALIGNX?程序進行序 列比對，并顯示于圖1中。ALIGNX?使用改良的Clustal W算法來生成蛋白質(zhì)或核酸序 列的多重序列比對以進行相似性比較和注解。用JALVIEW v2.3?軟件產(chǎn)生鄰居連接樹，并 顯不于圖 2。（Waterhouse et al. (2009)Bioinformatics 25 (9): 1189-1191)。如圖 2 中所 示，分離的序列的分析指示FAD2A和FAD2-3序列共享高水平的序列相似性，同樣地，F(xiàn)AD2-1 和FAD2-2共享高水平的序列相似性。四種序列可分類為兩個進化枝，其中FAD2A和FAD2-3 構(gòu)成第一進化枝，而FAD2-1和FAD2-2構(gòu)成第二進化枝。
[0099] 接著，用自油菜新分離的FAD2序列對自蕪菁基因組BAC文庫和甘藍鳥槍基因組 序列讀出分離的基因組文庫進行BLAST。蕪菁和甘藍二者均為雙二倍體物種油菜（AC基因 組，η = 19)的二倍體祖先。油菜衍生自蕪菁（A亞基因組，η = 10)和甘藍（C亞基因組，η =9)之間的最近雜交事件。使用BLASTn分析將二倍體祖先序列與自油菜分離的四種不同 FAD2編碼序列進行比較。此序列分析自蕪菁和甘藍鑒定出與新發(fā)現(xiàn)的油菜FAD2序列共享 最高序列相似性的具體的帶注釋的基因序列。表1列出了新鑒定的FAD2編碼序列和相應(yīng) 的祖先參照序列登錄號和來源生物體。
[0100] 表1 :來自油菜和相應(yīng)祖先生物體的FAD2序列及相關(guān)的FAD序列登錄號。
【主權(quán)項】
1. 一種包括分離包含目的多核苷酸的植物原生質(zhì)體、自一群植物細胞生成植物的方 法，該方法包括： 提供具有至少一個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體的一群植物原生質(zhì)體， 其中該群基本上沒有包含熒光標(biāo)志物且不包含目的多核苷酸的植物原生質(zhì)體；其中該植物 原生質(zhì)體由藻酸鈉封裝； 自該群中的其余植物原生質(zhì)體分出至少一個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生 質(zhì)體，由此分離包含目的多核苷酸的植物原生質(zhì)體； 自所述分離的植物原生質(zhì)體再生植物；并 培養(yǎng)所述植物。
2. 依照權(quán)利要求1的方法，其中分出至少一個原生質(zhì)體包括利用流式細胞術(shù)。
3. 依照權(quán)利要求1的方法，其中分出至少一個原生質(zhì)體包括利用熒光激活細胞分選 (FACS)〇
4. 依照權(quán)利要求1的方法，其中熒光標(biāo)志物為自植物原生質(zhì)體中的多核苷酸表達的熒 光多肽。
5. 依照權(quán)利要求1的方法，其中目的多核苷酸編碼目的多肽。
6. 依照權(quán)利要求5的方法，其中目的多肽為鋅指核酸酶。
7. 依照權(quán)利要求1的方法，其中該群植物原生質(zhì)體得自植物組織。
8. 依照權(quán)利要求1的方法，其包括分出包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的多數(shù)原生質(zhì) 體。
9. 依照權(quán)利要求1的方法，其中植物為單子葉植物或雙子葉植物。
10. 通過分離包含整合入植物原生質(zhì)體基因組的目的多核苷酸的植物原生質(zhì)體再生的 植物，該方法包括： 提供具有至少一個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體的一群植物原生質(zhì)體； 其中該植物原生質(zhì)體由藻酸鈉封裝； 自該群包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體回收微愈傷組織，其中該至少一個 包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體已經(jīng)用目的多核苷酸和編碼熒光標(biāo)志物的多 核苷酸轉(zhuǎn)化； 自所述微愈傷組織再生植物；并 培養(yǎng)所述植物。
11. 依照權(quán)利要求9的方法，其中目的多核苷酸和編碼熒光標(biāo)志物的多核苷酸均存在 于用于轉(zhuǎn)化至少一個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體的核酸分子中。
12. 依照權(quán)利要求9的方法，其中目的多核苷酸和編碼熒光標(biāo)志物的多核苷酸整合在 至少一個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體的基因組中。
13. 依照權(quán)利要求12的方法，其中目的多核苷酸和編碼熒光標(biāo)志物的多核苷酸以位點 特異性方式整合在至少一個原生質(zhì)體的基因組中。
14. 依照權(quán)利要求13的方法，其中目的多核苷酸和編碼熒光標(biāo)志物的多核苷酸通過利 用鋅指核酸酶以位點特異性方式整合。
15.-種用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括： 提供具有至少一個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生質(zhì)體的一群植物原生質(zhì)體， 其中至少一個原生質(zhì)體包含位點特異性核酸酶，使得目的多核苷酸能夠通過位點特異性核 酸酶的識別位點處的同源重組整合在至少一個植物原生質(zhì)體的基因組中且其中該植物原 生質(zhì)體由藻酸鈉封裝； 自該群中的其余植物原生質(zhì)體分出至少一個包含目的多核苷酸和熒光標(biāo)志物的原生 質(zhì)體； 自至少一個原生質(zhì)體再生轉(zhuǎn)基因植物；并 培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物。
16. 通過依照權(quán)利要求15的方法生成的植物，其中該植物生成由目的多核苷酸編碼的 目的多肽。
17. 通過依照權(quán)利要求15的方法生成的植物，其中該植物包含由目的多核苷酸賦予植 物的價值增加性狀。
18. -種生成種子的方法，其包括FACS分選、培養(yǎng)/優(yōu)化和再生、培養(yǎng)植物、回收種子。
【專利摘要】描述了一種工程化轉(zhuǎn)基因整合平臺(ETIP)，它能在植物基因組中隨機地或在靶定位置處插入，從而推動快速選擇和檢測完美靶定(3'和5'端二者)在ETIP基因組位置處的GOI。本發(fā)明中的一個要件是在ETIP內(nèi)引入特定雙鏈斷裂。在一些實施方案中，描述了一種ETIP，它使用鋅指核酸酶結(jié)合位點，但是可利用其它靶向技術(shù)，諸如大范圍核酸酶、TAL、CRISPR、或亮氨酸拉鏈。還描述了轉(zhuǎn)基因植物的組合物和用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中供體或有效載荷DNA表達穩(wěn)定整合入植物細胞中ETIP的外源核酸序列的一種或多種產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)或RNA)。在多個實施方案中，從構(gòu)思貫穿開發(fā)階段，ETIP推動測試基因候選和植物表達載體。
【IPC分類】C12Q1-24, A01H5-00, C12N15-82
【公開號】CN104736712
【申請?zhí)枴緾N201380054087
【發(fā)明人】G·斯潘根伯格, S·薩哈布, J·梅森
【申請人】美國陶氏益農(nóng)公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2013年9月9日
【公告號】CA2883800A1, EP2893024A1, US20140075593, WO2014039970A1, WO2014039970A9