一種用于制備抗體的抗原預處理方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明公開的是一種用于制備抗體的抗原預處理方法，涉及免疫學技術領域。
【背景技術】
[0002]免疫組化技術是20世紀70年代初Sterb Berger在酶標法的基礎上以免疫學的抗原抗體反應為理論基礎發(fā)展起來的一門方法學，是對組織和細胞內(nèi)的特定抗原或抗體(多肽和蛋白質(zhì))進行定位、定性或定量檢測的一門技術。免疫組化技術在生物學領域尤其是在基礎醫(yī)學和臨床研宄中發(fā)揮著極其重要的作用，其技術的引入改變了對腫瘤的診斷和分類的研宄深度，使其從細胞水平提高到了生物化學水平、分子水平，大大提高了腫瘤診斷的準確性和靈敏度，為腫瘤的治療打下了良好的基礎。免疫組織化學技術目前主要的應用于臨床檢測，包括以下幾個方面:(I)良性和惡性腫瘤的診斷與鑒定；(2)腫瘤分期；(3)腫瘤來源的鑒定；(4)區(qū)分組織器官交界處腫瘤；(5)發(fā)現(xiàn)微小轉移灶；(6)感染性疾病的診斷；(7)指導腫瘤的治療。
[0003]抗體是至今為止醫(yī)療分子發(fā)展十分迅速的一類免疫效應分子，在生物醫(yī)學領域疾病診治中得到廣泛應用。發(fā)展至今，抗體的制備技術可以歸納為三個發(fā)展階段，即多克隆抗血清、單克隆抗體和第三代基因工程抗體。當今市場上應用于免疫組化領域的抗體主要有多克隆抗血清和單克隆抗體，主要是鼠多抗、鼠單抗、兔單抗。制備高特異性、高靈敏性抗體的關鍵是抗原的選擇。目前免疫老鼠的抗原分為人工合成的免疫原、從組織中提取的蛋白以及基因工程表達的蛋白，抗原的預處理一般是進行蛋白純化。免疫組化技術需要準確定位抗原在組織的表達位置，因此抗體或抗原的設計應更具有針對性。只進行簡單的蛋白純化步驟得到的抗原缺乏針對性和目的性，將其作為免疫原制備的抗體在免疫組化技術的應用上經(jīng)常存在抗體的定位不準確、特異性較差現(xiàn)象。鑒于此，在WB、ELISA技術上應用良好的優(yōu)質(zhì)抗體大多不能夠適用于免疫組化技術。通過結合已有的抗原預處理方法和免疫組化的操作流程，本發(fā)明技術采用抗原修復液進一步預處理抗原，為制備適用于免疫組化的抗體奠定基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對免疫組化技術的特點以及現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種用于制備抗體的抗原預處理方法，具有操作簡便、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
[0005]本發(fā)明的一種用于制備抗體的抗原預處理方法，是采用抗原修復液處理純化后的抗原蛋白。
[0006]所述抗原修復液為EDTA緩沖液、檸檬酸緩沖液或Tris緩沖液。
[0007]三種抗原修復液均為常規(guī)抗原修復液，選用任一種抗原修復液預處理后的抗原蛋白均可用于免疫動物，獲得抗血清，或產(chǎn)生抗體的漿細胞，用于制備針對抗原的單克隆抗體。
[0008]所述的EDTA緩沖液處理抗原蛋白操作如下:在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1mol/L、pH值為7.0-10.0的EDTA緩沖液，抗原蛋白終濃度為0.01-200mg/mL，50_120°C處理30s_30mino
[0009]更優(yōu)選地，所述的EDTA緩沖液處理抗原蛋白操作如下:在抗原蛋白溶液中加入
0.01 mol/L，pH8.0-9.0 的 EDTA 緩沖液，抗原蛋白終濃度為 0.01_200mg/mL，80_100°C處理15_25min0
[0010]所述的檸檬酸緩沖液處理抗原蛋白操作如下:在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1mol/L、pH值為4.0-7.0的檸檬酸緩沖液，抗原蛋白終濃度為0.01-200mg/mL，50_120°C處理30s_30mino
[0011]更優(yōu)選地，所述的檸檬酸緩沖液處理抗原蛋白操作如下:在抗原蛋白溶液中加入
0.01 mol/L, pH5.0-6.0的檸檬酸緩沖液，抗原蛋白終濃度為0.01_200mg/mL，100_120°C處理60s-120so
[0012]所述的Tris緩沖液處理抗原蛋白操作如下:在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1mol/L, pH值為6.0-9.0的Tris緩沖液，抗原蛋白終濃度為0.01_200mg/mL，50_120°C處理30s_30mino
[0013]更優(yōu)選地，所述的Tris緩沖液處理抗原蛋白操作如下:在抗原蛋白溶液中加入0.01 mol/L, pH值為7.0-8.0的的Tris緩沖液，抗原蛋白終濃度為0.01_200mg/mL，80-100°C 處理 15-25min。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點:
根據(jù)免疫組化的關鍵步驟:抗原修復，選擇相應的抗原修復液處理抗原，有針對性地設計可應用于免疫組化的抗原預處理方法，即根據(jù)抗原的處理方式選擇抗體的免疫組化的修復方式；本方法操作簡便、生產(chǎn)成本低，為制備應用于免疫組化的抗體提供了一條新穎有效的途徑。
【附圖說明】
[0015]圖1為EDTA抗原修復液處理組抗體免疫組化染色圖；其中A:空白對照；B:陰性對照；C: pH值為7.0的EDTA抗原修復液處理組；D: pH值為8.0的EDTA抗原修復液處理組；E: pH值為9.0的EDTA抗原修復液處理組；F: pH值為10.0的EDTA抗原修復液處理組。
[0016]圖2為檸檬酸抗原修復液處理組抗體免疫組化染色圖；其中A:空白對照；B:陰性對照；C: pH值為4.0的檸檬酸抗原修復液處理組；D: pH值為5.0的檸檬酸抗原修復液處理組；E: pH值為6.0的檸檬酸抗原修復液處理組；F: pH值為7.0的檸檬酸抗原修復液處理組。
[0017]圖3為Tris抗原修復液處理組抗體免疫組化染色圖；其中A:空白對照；B:陰性對照；C: pH值為6.0的Tris抗原修復液處理組；D: pH值為7.0的Tris抗原修復液處理組；E: pH值為8.0的Tris抗原修復液處理組；F: pH值為9.0的Tris抗原修復液處理組。
【具體實施方式】
[0018]實施例1
在抗原蛋白溶液一(膜蛋白)中分別加入0.01 11101/1、？!1值為7.0、8.0、9.0、10.0的EDTA緩沖液，抗原蛋白溶液一終濃度為lmg/mL，100°C處理20min。
[0019]分別用抗原修復液處理和未處理的抗原蛋白免疫老鼠，免疫三次后，ELISA檢測血液抗體效價，檢測效價達106，用抗體稀釋劑將抗體稀釋1000倍后進行免疫組化實驗(《免疫組化試驗手冊》)。本實驗以采用未處理抗原蛋白免疫的老鼠作為陰性對照，未免疫的空白老鼠作為空白對照。免疫組化染色結果如圖1所示。
[0020]由圖1可以看出，A圖空白對照為免疫組化陰性結果，B圖陰性對照的免疫組化染色結果膜蛋白定位模糊且染色彌散，從C、D、E、F圖的比較來看，pH值為8.0,9.0的EDTA緩沖液處理組的免疫組化染色定位清晰、著色明顯，非特異性染色少，故確定其為最佳條件。
[0021]實施例2
在抗原蛋白溶液二 (膜蛋白)中分別加入0.01 mol/L, ?!1值為4.0、5.0、6.0、7.0的檸檬酸緩沖液，抗原蛋白終濃度為lmg/mL，120°C處理90s。
[0022]分別用抗原修復液處理和未處理的抗原蛋白免疫老鼠，免疫三次后，ELISA檢測血液抗體效價，檢測效價達106，用抗體稀釋劑將抗體稀釋1000倍后進行免疫組化實驗。本實驗以采用未處理抗原蛋白免疫的老鼠作為陰性對照，未免疫的空白老鼠作為空白對照。免疫組化染色結果如圖2所示。
[0023]由圖2可以看出，A圖空白對照為免疫組化陰性結果，B圖陰性對照的免疫組化染色結果膜蛋白定位模糊且染色彌散，從C、D、E、F圖的比較來看，pH值為5.0、6.0的檸檬酸緩沖液處理組的免疫組化染色定位清晰、著色明顯，非特異性染色少，故確定其為最佳條件。
[0024]實施例3
在抗原蛋白溶液三(膜蛋白沖分別加入0.01 mol/L、pH值為6.0,7.0,8.0,9.0的Tris緩沖液，抗原蛋白溶液三終濃度為lmg/mL，100°C處理20min。
[0025]分別用抗原修復液處理和未處理的抗原蛋白免疫老鼠，免疫三次后，ELISA檢測血液抗體效價，檢測效價達106，用抗體稀釋劑將抗體稀釋1000倍后進行免疫組化實驗。本實驗以采用未處理抗原蛋白免疫的老鼠作為陰性對照，未免疫的空白老鼠作為空白對照。免疫組化染色結果如圖3所示。
[0026]由圖3可以看出，A圖空白對照為免疫組化陰性結果，B圖陰性對照的免疫組化染色結果膜蛋白定位模糊且染色彌散，從C、D、E、F圖的比較來看，pH值為8.0,9.0的Tris緩沖液處理組的免疫組化染色定位清晰、著色明顯，非特異性染色少，故確定其為最佳條件。
【主權項】
1.一種用于制備抗體的抗原預處理方法，其特征在于:采用抗原修復液處理純化后的抗原蛋白。
2.根據(jù)權利要求1所述用于制備抗體的抗原預處理方法，其特征在于:所述抗原修復液為EDTA緩沖液、檸檬酸緩沖液或Tris緩沖液。
3.根據(jù)權利要求2所述用于制備抗體的抗原預處理方法，其特征在于:所述EDTA緩沖液的處理條件為:在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1 mol/L、pH值為7.0-10.0的EDTA緩沖液，抗原蛋白終濃度為0.01-200mg/mL，50-120°C處理30s_30min。
4.根據(jù)權利要求3所述用于制備抗體的抗原預處理方法，其特征在于:所述EDTA緩沖液的處理條件為:在抗原蛋白溶液中加入0.01 mol/L, pH值為8.0-9.0的EDTA緩沖液，抗原蛋白終濃度為 0.01-200mg/mL，80-100°C處理 15_25min。
5.根據(jù)權利要求2所述用于制備抗體的抗原預處理方法，其特征在于:所述檸檬酸緩沖液的處理條件為:在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1 mol/L、pH值為4.0-7.0的檸檬酸緩沖液，抗原蛋白終濃度為0.01-200mg/mL，50-120°C處理30s_30min。
6.根據(jù)權利要求5所述用于制備抗體的抗原預處理方法，其特征在于:所述檸檬酸緩沖液的處理條件為:在抗原蛋白溶液中加入0.01 mol/L、pH值為5.0-6.0的檸檬酸緩沖液，抗原蛋白終濃度為 0.01-200mg/mL，100_120°C處理 60s_120s。
7.根據(jù)權利要求2所述用于制備抗體的抗原預處理方法，其特征在于:所述Tris緩沖液的處理條件為:在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1 mol/L, pH值為6.0-9.0的Tris緩沖液，抗原蛋白終濃度為0.01-200mg/mL，50-120°C處理30s_30min。
8.根據(jù)權利要求7所述用于制備抗體的抗原預處理方法，其特征在于:所述Tris緩沖液的處理條件為:在抗原蛋白溶液中加入0.01 mol/L、pH值為7.0-8.0的Tris緩沖液，抗原蛋白終濃度為 0.01-200mg/mL，80-100°C處理 15_25min。
【專利摘要】本發(fā)明公開的是一種用于制備抗體的抗原預處理方法，涉及免疫學技術領域。該方法采用抗原修復液處理純化后的抗原蛋白。本發(fā)明的目的是在于針對免疫組化技術的特點以及現(xiàn)有技術存在的不足，提供的抗原預處理方法，具有操作簡便、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。本發(fā)明根據(jù)免疫組化的關鍵步驟：抗原修復，選擇相應的抗原修復液處理抗原，有針對性地設計可應用于免疫組化的抗原預處理方法，即根據(jù)抗原的處理方式選擇抗體的免疫組化的修復方式；本方法操作簡便、生產(chǎn)成本低，為制備應用于免疫組化的抗體提供了一條新穎有效的途徑。
【IPC分類】C07K1-00, C07K16-00
【公開號】CN104744588
【申請?zhí)枴緾N201510156594
【發(fā)明人】孟春, 鄭美云, 王航, 陳小媛
【申請人】福州大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年4月3日