一種新疆紫草內(nèi)生真菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說，是一種新疆紫草內(nèi)生真菌，及其菌絲的水溶性 提取物（WAE)用于促進(jìn)新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)和提高紫草素類成分含量的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫草是我國(guó)的常用中藥材，味甘、咸，性寒，歸心、肝經(jīng)，具有涼血、活血、解毒透瘆 等功效。《中華人民共和國(guó)藥典》（2010版)收錄紫草的主要來源為紫草科（Boraginaceae) 新疆紫草A 或內(nèi)蒙紫草A講的干燥根。紫草藥材的有效成分是萘醌 類成分紫草素及其衍生物和紫草多糖，而研宄表明新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.比內(nèi)蒙紫草的萘醌類有效成分的含量高，臨床療效好，利用價(jià)值高，為新疆特有種， 有"道地藥材"之譽(yù)，因而行銷國(guó)內(nèi)外，已成為是傳統(tǒng)中藥材紫草的主要來源。然而近些年， 由于紫草藥用部位是根部，無節(jié)制的采挖和盜挖導(dǎo)致野生資源破壞嚴(yán)重，新疆紫草已被列 為國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生藥材。由于新疆紫草產(chǎn)于新疆天山海拔2600~3300m的高寒山 區(qū)和草甸帶，野生狀態(tài)下對(duì)生境要求嚴(yán)格，因此尚無馴化成功和大面積人工栽培成功的報(bào) 道，少量栽培紫草品質(zhì)參差不齊，不能批量供應(yīng)市場(chǎng)。因此，有效提高栽培紫草的品質(zhì)、促進(jìn) 新疆紫草的大面積規(guī)范化種植及產(chǎn)業(yè)化成為另一個(gè)迫切需要解決的問題。
[0003] 植物內(nèi)生真菌（Endophyticfungiorfungalendophtes)是指在生活史中的某 一個(gè)階段存在于健康植物組織內(nèi)部，不會(huì)引起宿主明顯病癥或者對(duì)宿主造成明顯傷害的真 菌。研宄表明，在目前研宄過的所有植物中均發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生菌，可存在于植物的根、莖、葉、花、 果實(shí)等各個(gè)部位。1993年，Strobel等首次報(bào)道了從短葉紫杉Tkrys△reri/b/ia的樹皮 中分離得到一株能夠產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌引起了國(guó)內(nèi)外眾多研 宄者的極大關(guān)注，紛紛把目光投向藥用植物內(nèi)生真菌的研宄。近二十年藥用植物內(nèi)生真菌 的研宄多集中在內(nèi)生真菌的生物多樣性、次生代謝產(chǎn)物和內(nèi)生真菌與宿主之間的相互關(guān)系 等方面。內(nèi)生真菌在生產(chǎn)天然藥用成分、豐富天然藥物寶庫中的作用已被許多研宄所證實(shí)。 除此之外，研宄還發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)，增強(qiáng)宿主的抗逆性，促進(jìn)藥 用植物中有效成分的積累，已成為中藥品質(zhì)研宄一個(gè)嶄新的發(fā)展方向。但是關(guān)于一種新疆 紫草內(nèi)生真菌及其菌絲的水溶性提取物（WAE)用于促進(jìn)新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)和提高紫草素 類成分含量的用途目前還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是，提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是，提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物。
[0007] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物的制備方 法。
[0008] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是，提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物的應(yīng)用。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種新疆紫草內(nèi)生真菌，所述的新疆 紫草內(nèi)生真菌的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4712。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的新疆紫草內(nèi)生真菌在 促進(jìn)新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)和提高新疆紫草毛狀根中紫草素類成分含量中的應(yīng)用。
[0011] 所述的紫草素類成分為紫草素或乙酰紫草素。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲 水溶性提取物，所述的菌絲水溶性提取物的制備方法為：收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的所述的 新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲體，加入蒸餾水重懸，100-120°C滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得 到的濾液，即為新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲 水溶性提取物的制備方法，包括以下步驟：收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的所述的新疆紫草內(nèi)生 真菌菌絲體，加入蒸餾水重懸，100-120°C滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即 為新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述第五個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的新疆紫草內(nèi)生真菌菌 絲水溶性提取物在促進(jìn)新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)和提高新疆紫草毛狀根中紫草素類成分含量 中的應(yīng)用。
[0015] 所述的紫草素類成分為紫草素或乙酰紫草素。
[0016] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于： 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種新疆紫草內(nèi)生真菌，并從新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲中制備了水溶 性提取物（WAE)，發(fā)現(xiàn)WAE能有效促進(jìn)新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)，同時(shí)能顯著性地提高毛狀根中 紫草素類成分的含量。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0018] 本發(fā)明提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌，其分類命名為深綠木霉 atrwiriofe，菌株代號(hào)為AE9,保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，保藏日期 (2011年3月27日），保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4712。
[0019] 它的顯微形態(tài)為：培養(yǎng)的菌絲體無色、分枝繁復(fù)，由具有橫隔的分枝菌絲構(gòu)成，分 枝角度為近似90°;分生孢子梗的可育延伸物沒有或者很少產(chǎn)生，沒有不育的菌毛；雖然成 對(duì)著生的分枝比較常見，但是分生孢子梗的典型分枝方式為單側(cè)分枝；分生孢子綠色，亞球 形至卵圓形，沒有明顯的脫落痕跡，光滑，成簇著生于分生孢子梗的頂端。
[0020] 1.新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物（WAE)的制備。
[0021] 收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的以上所述新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲體，加入適量蒸餾水重 懸，100-120°C滅菌30-60min。待自然冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即為新疆紫草內(nèi)生真菌 水溶性提取物。
[0022] 2.新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物（WAE)對(duì)新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)和紫草素 生物合成的影響。
[0023] 在新疆紫草毛狀根懸浮培養(yǎng)第16-24天，添加總糖濃度為50-400 mg/L的新疆紫 草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物WAE，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)12-30天，毛狀根生物量提高了 12%-55%， 紫草素的含量提高了 15-40倍，乙酰紫草素的含量提高了 4-14倍。新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲 水溶性提取物菌絲WAE能夠有效地提高新疆紫草毛狀根的生物量，促進(jìn)紫草素類成分的生 物合成。
[0024] 實(shí)施例1內(nèi)生深綠木霉菌AE9的發(fā)酵 將新疆紫草內(nèi)生真菌AE9接種至1/2B5固體培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)3-5天；然后采用打孔 器打孔的方式將固體培養(yǎng)基上的D16菌絲接種至250ml三角瓶（內(nèi)含100ml1/2B5培養(yǎng)液） 中，26°C、180rpm培養(yǎng)3-5天即得培養(yǎng)種子液；最后將培養(yǎng)種子液接種至5L三角瓶（內(nèi)含4L 1/2B5培養(yǎng)液）中，26°C、160rpm培養(yǎng)10天。
[0025] 實(shí)施例2新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物（WAE)的制備 收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的新疆紫草內(nèi)生真菌AE9菌絲體，加入適量蒸餾水重懸，高壓鍋 110°C滅菌30-60min。待自然冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即為新疆紫草內(nèi)生真菌水溶性 提取物。采用硫酸-苯酚法測(cè)定總糖濃度。
[0026] 實(shí)施例3新疆紫草毛狀根的擴(kuò)繁和生產(chǎn) 1.毛狀根擴(kuò)繁 將2~4cm的毛狀根接種在裝有50mLSH培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，蔗糖30g/L， 肌醇1g/L，水解酪蛋白0.5g/L。培養(yǎng)液pH5. 8,在20~25°C，搖床速度（100-4-10) r/min，暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)15d收獲，備用。
[0027] 2.毛狀根生產(chǎn)階段 將1培養(yǎng)的毛狀根接種在裝有100mLM-9培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，接種量2g/ 瓶，培養(yǎng)基口!15.8，蔗糖30 8/1。在20-251：、搖床轉(zhuǎn)速為（100+10)1'/1^11下暗培養(yǎng)。 培養(yǎng)25d收獲，滅菌吸水紙吸干其表面水分，稱重，計(jì)算毛狀根增殖倍數(shù)。
[0028] 實(shí)施例4新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物（WAE)對(duì)新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)和 紫草素類成分生物合成的影響 根據(jù)實(shí)施例2制備AE9菌絲WAE溶液。按硫酸-苯酚法測(cè)定的總糖濃度后，添加一定 體積的WAE溶液配制成總糖濃度為75、150、300mg/L的1/2B5誘導(dǎo)培養(yǎng)液，110°C滅菌30 分鐘后自然冷卻待用。將正常培養(yǎng)21天的新疆紫草毛狀根的培養(yǎng)液更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼 續(xù)培養(yǎng)18天后收獲。新疆紫草毛狀根干重和2種紫草素含量見表1。從表中數(shù)據(jù)可以看 出，不同濃度的WAE均能顯著性地提高新疆紫草毛狀根的生物量；誘導(dǎo)濃度為300mg/L時(shí) 效果最好，毛狀根的生物量提高了 55%。同時(shí)不同濃度的WAE也均能顯著性地提高新疆紫草 毛狀根中紫草素類成分的含量：紫草素的含量提高了 15-40倍，乙酰紫草素的含量提高了 4-14倍。內(nèi)生真菌AE9菌絲WAE能夠有效地提高新疆紫草毛狀根的生物量，促進(jìn)紫草素類 成分的生物合成。
[0029] 表1 新疆紫草內(nèi)生真菌AE9菌絲水提取物對(duì)新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)和紫草素合 成的影響（X土SD，n=10)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新疆紫草內(nèi)生真菌，其特征在于，所述的新疆紫草內(nèi)生真菌的保藏編號(hào)為CGMCC No. 4712〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新疆紫草內(nèi)生真菌在促進(jìn)新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)和提高新疆 紫草毛狀根中紫草素類成分含量中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的紫草素類成分為紫草素或乙酰紫 草素。
4. 一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物，其特征在于，所述的菌絲水溶性提取物 的制備方法為：收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的權(quán)利要求1所述的新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲體，加入 蒸餾水重懸，100-120°C滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即為新疆紫草內(nèi)生真 菌菌絲水溶性提取物。
5. -種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的權(quán)利要求1所述的新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲體，加入蒸餾水重懸， 100-120°C滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即為新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶 性提取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物在促進(jìn)新疆紫草毛狀 根生長(zhǎng)和提高新疆紫草毛狀根中紫草素類成分含量中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的紫草素類成分為紫草素或乙酰紫 草素。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新疆紫草內(nèi)生真菌及其應(yīng)用，所述的新疆紫草內(nèi)生真菌的保藏編號(hào)為CGMCC No.4712。本發(fā)明還提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物及其制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種新疆紫草內(nèi)生真菌，并從新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲中制備了水溶性提取物（WAE），發(fā)現(xiàn)WAE能有效促進(jìn)新疆紫草毛狀根生長(zhǎng)，同時(shí)能顯著性地提高毛狀根中紫草素類成分的含量。CGMCC No. 471220110327
【IPC分類】A01N63-04, A01P21-00, C12N1-14, C12R1-645, A01G7-06
【公開號(hào)】CN104745482
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410461671
【發(fā)明人】韓婷, 秦路平, 賈曉光, 鄭承劍, 賈敏
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2014年9月12日