茄子查爾酮異構(gòu)酶SmCHI蛋白及其編碼基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及茄子花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶及其編碼基因，具體涉及一種茄子查 爾酮異構(gòu)酶SmCHI蛋白及其編碼基因，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 人體內(nèi)由于新陳代謝活動(dòng)不可避免的會(huì)產(chǎn)生大量自由基，花青素作為一種強(qiáng)還原 性物質(zhì)，能夠清除人體內(nèi)的自由基，延緩機(jī)體衰老?；ㄇ嗨氐暮铣赏緩绞穷?lèi)黃酮合成途徑的 一部分，也是目前研宄的非常廣泛而深入的植物次生代謝途徑，其在主要模式植物如擬南 芥、矮牽牛中已被詳細(xì)闡述。花青素的生物合成主要分為三個(gè)階段：第一階段由苯丙氨酸到 香豆酰CoA，這是許多次生代謝共有的步驟；第二階段由香豆酰CoA到二氫黃酮醇，這是類(lèi) 黃酮代謝的關(guān)鍵步驟，它合成花青素和其他黃酮物質(zhì)的前體；第三階段是各類(lèi)花青素的合 成。
[0003] 查爾酮異構(gòu)酶是催化類(lèi)黃酮合成途徑中的第二個(gè)關(guān)鍵酶，將查爾酮環(huán)化形成花青 素的骨架黃烷酮。該反應(yīng)的一個(gè)重要特點(diǎn)是將黃色的查爾酮轉(zhuǎn)變成了無(wú)色黃烷酮。植物的 這一步反應(yīng)在沒(méi)有CHI的情況下也可自發(fā)進(jìn)行，但在CHI的催化下反應(yīng)速率是自發(fā)進(jìn)行的 1〇7倍。應(yīng)用基因工程技術(shù)將CHI基因?qū)说街参镏?，其表達(dá)產(chǎn)物可以促進(jìn)有益于人體健康 的黃酮類(lèi)化合物的生物合成，改變花色、果色，改善口感等，具有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用的前景。將 康乃馨花瓣中的CHI基因突變，會(huì)使白色的花朵變成黃色；將矮牽牛CHI基因轉(zhuǎn)入番茄中， 其果皮中黃酮類(lèi)含量增加了 78倍，果肉中黃烷醇增加了 21倍。將CHS正義基因和CHI反 義基因?qū)说教鸪戎?，苦味物質(zhì)的合成量減少，口感更好了。
[0004] 目前已從很多植物中克隆得到CHI基因，如擬南芥、蘋(píng)果、矮牽牛、葡萄、大豆等。 茄子是花青素含量最為豐富的蔬菜作物之一，但對(duì)于茄子CHI基因的克隆、表達(dá)模式及其 啟動(dòng)子序列目前尚不清楚。目前，未有任何與茄子CHI基因及其編碼蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于填補(bǔ)茄子CHI家族成員的克隆、表達(dá)模式分析以及茄子CHI蛋 白及其編碼基因的空白。本發(fā)明提供了一種茄子CHI的cDNA、gDNA以及氨基酸序列；進(jìn)一 步地，本發(fā)明提供了茄子SmCHI基因的亞細(xì)胞定位，還提供了茄子SmCHI基因在不同組織器 官及低溫下的表達(dá)模式。本發(fā)明還提供了SmCHI基因的啟動(dòng)子序列及其元件分析。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，其包括：
[0008] (a)由如SEQIDN0. 3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或
[0009] (b)在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有茄 子查爾酮異構(gòu)酶活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0010] 作為優(yōu)選方案，所述蛋白質(zhì)包括SEQIDN0. 3所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1~50個(gè)氨基 酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20個(gè)以?xún)?nèi)氨基酸而得到 的氨基酸序列。
[0011] 作為優(yōu)選方案，所述蛋白質(zhì)為SEQIDN0. 3所示氨基酸序列中1~10個(gè)氨基酸被 性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
[0012] 第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼權(quán)利要求1所述的具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性 的蛋白質(zhì)的基因的核酸序列，所述基因的gDNA序列如SEQIDN0. 2所不。
[0013] 作為優(yōu)選方案，所述基因的cDNA序列包括：
[0014] (a)如SEQIDNO. 1第1~705位所示的堿基序列；或
[0015] (b)與SEQIDNO. 1第1~705位所示的堿基序列具有至少70%的同源性的堿基 序列；或
[0016] (C)能與SEQIDNO. 1第1~705位所示的堿基序列進(jìn)行雜交的堿基序列。
[0017] 作為優(yōu)選方案，所述核酸序列包括SEQIDNO. 1第1~705位所示的核酸序列中 1~90個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個(gè)以?xún)?nèi)核苷酸。[0018] 第三方面，本發(fā)明提供了一對(duì)用于擴(kuò)增權(quán)利要求4所述基因的核酸序列的gDNA的 引物，所述引物的序列如SEQIDN0. 7和SEQIDN0. 8所示。
[0019]第四方面，本發(fā)明提供了一對(duì)用于擴(kuò)增權(quán)利要求4或5所述基因的核酸序列的cDNA的引物，所述引物的序列如SEQIDN0. 5和SEQIDN0. 6所示。
[0020] 第五方面，本發(fā)明還提供了一種具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的基因的核 酸序列的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包括SEQIDN0. 4中所示的堿基序列。
[0021] 在本發(fā)明中，"分離的DNA"、"純化的DNA"是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位 于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開(kāi)， 而且已經(jīng)與在細(xì)胞中相伴隨的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
[0022] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"SmCHI蛋白編碼序列"指編碼具有茄子SmCHI蛋白活性的多肽 的核苷酸序列，如SEQIDNO. 1所示的第1~705位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序 列是指，位于SEQIDNO. 1所示的第1~705位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同 氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQIDNO. 1 所示的第1~705位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQIDNO. 3所 示的氨基酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核 苷酸序列。
[0023] 該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的茄子SmCHI相同功能的蛋白的SEQIDNO. 1所 示序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：通常為1~90個(gè)核苷酸的缺失、 插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個(gè)以?xún)?nèi)核苷酸。
[0024] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"SmCHI蛋白"指具有茄子SmCHI蛋白活性的SEQIDN0. 3所示 序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與茄子SmCHI蛋白相同功能的、SEQIDNO. 3序列的變異 形式。這些變異形式包括（但并不限于）：通常為1~50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取 代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或?yàn)?0個(gè)以?xún)?nèi)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能 相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括茄子SmCHI蛋白 的活性片段和活性衍生物。
[0025] 本發(fā)明的茄子SmCHI蛋白的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異 體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與茄子SmCHI相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用茄子SmCHI蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0026] 在本發(fā)明中，"茄子SmCHI保守性變異多肽"指與SEQ ID N0. 3所示的氨基酸序列 相比，有至多10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異 多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
[0027]表1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，包括： (a) 由如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或 (b) 在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有茄子查 爾酮異構(gòu)酶活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋 白質(zhì)包括SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1~50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，或 者在C末端和/或N末端添加1~20個(gè)以?xún)?nèi)氨基酸而得到的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述 蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列中1~10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所 替換而形成的序列。
4. 一種編碼權(quán)利要求1所述的具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的基因的核酸序 列，其特征在于，所述基因的gDNA序列如SEQ ID NO. 2所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的編碼所述具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的基因的核 酸序列，其特征在于，所述基因的cDNA序列包括： (a) 如SEQ ID NO. 1第1~705位所示的堿基序列；或 (b) 與SEQ ID NO. 1第1~705位所示的堿基序列具有至少70 %的同源性的堿基序列； 或 (c) 能與SEQ ID NO. 1第1~705位所示的堿基序列進(jìn)行雜交的堿基序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的基因的核酸序列，其 特征在于，包括SEQ ID NO. 1第1~705位所示的核酸序列中1~90個(gè)核苷酸的缺失、插 入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個(gè)以?xún)?nèi)核苷酸形成的堿基序列。
7. -對(duì)用于擴(kuò)增權(quán)利要求4所述基因的核酸序列的gDNA的引物，所述引物的序列如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
8. -對(duì)用于擴(kuò)增權(quán)利要求4或5所述基因的核酸序列的cDNA的引物，所述引物的序列 如 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。
9. 一種權(quán)利要求4所述的具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的基因的核酸序列的 啟動(dòng)子，其特征在于，所述啟動(dòng)子包括SEQ ID NO. 4中所示的堿基序列。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種茄子查爾酮異構(gòu)酶SmCHI蛋白及其編碼基因，所述蛋白包括：(a)由如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有茄子查爾酮異構(gòu)酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；所述編碼基因的cDNA和gDNA分別具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示堿基序列；該基因在根、莖、葉、花、果皮、果肉均有表達(dá)，果皮中的表達(dá)量顯著高于其他組織。低溫脅迫下，其表達(dá)量在48h達(dá)到最大值，為未處理的3.65倍。本發(fā)明為今后利用基因工程技術(shù)改良植物品質(zhì)，獲得高抗氧化性的藥物或食物提供理論依據(jù)，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】C12N15-113, C12N15-61, C12N9-90, C12N15-11
【公開(kāi)號(hào)】CN104745561
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510112447
【發(fā)明人】陳火英, 蔣明敏, 任麗, 高莉潔, 周騰夏
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年3月13日