一種從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 正常人的臍帶含有三條血管：兩條臍動(dòng)脈（PluralArteriae umbilicales)和一 條臍靜脈（Vena umbilicalis)。兩條動(dòng)脈將二氧化碳豐富和營養(yǎng)少的血輸入胎盤，靜脈將 氧氣和營養(yǎng)豐富的血液輸回胎兒。另一條動(dòng)脈在胎兒的第一周就退化了。動(dòng)脈輸送靜脈血 (富含二氧化碳和廢物的血）、靜脈輸送動(dòng)脈血（富含氧氣和營養(yǎng)的血）的血管除肺動(dòng)脈/ 靜脈外就只有臍動(dòng)脈/靜脈。人的臍帶約50至60厘米長，直徑約2厘米，臍帶內(nèi)的血管由 華通氏膠（Wharton's Jelly)包裹，華通氏膠中有干細(xì)胞。
[0003]間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬 于多能干細(xì)胞，MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植 入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特 定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組 織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰 老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)
[0004] 目前，已經(jīng)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)研宄證實(shí)，在終末期肝病治療中，MSCs移植能夠明顯改 善患者的肝功能；而將皮膚角質(zhì)細(xì)胞與MSCs混合后進(jìn)行移植，可有效延長移植皮膚的存活 時(shí)間并減少異體移植物抗免疫疾?。╣raft versus host disease，GVHD)。對(duì)于SCs免疫 調(diào)節(jié)機(jī)制的研宄認(rèn)為，MSCs主要通過旁分泌作用，產(chǎn)生多種免疫調(diào)節(jié)因子，作用于免疫細(xì)胞 后，誘導(dǎo)免疫耐受，從而發(fā)揮調(diào)控機(jī)體的免疫的作用。
[0005] 此外，通過將MSCs進(jìn)行基因修飾，把IFNf3、EP0等基因?qū)肫浠蚪M中，可獲得 能夠在體內(nèi)長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)該蛋白或細(xì)胞因子的功能性細(xì)胞。吳祖澤等人把HGF的基因?qū)?入MSCs中，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)HGF基因轉(zhuǎn)染的人骨髓MSC仍維持原有的增殖和分化能力，而 對(duì)體外細(xì)胞免疫反應(yīng)具有更強(qiáng)的抑制效果，因此在組織器官移植中存在更大的潛在應(yīng)用價(jià) 值（邊莉，郭子寬，艾輝勝，王華，孟二紅，吳祖澤，王立生；HGF基因修飾增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞 的免疫抑制作用；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊；2006, 30(4) :323-328)。正因如此，目前各國均投 入大量人力物力經(jīng)費(fèi)進(jìn)行廣泛和深入的研宄。但所有的研宄或治療方案都必須建立在足夠 量MSCs獲取的基礎(chǔ)上，因此建立穩(wěn)定有效快速的MSCs分離、擴(kuò)增、質(zhì)量控制的技術(shù)體系具 有重要的意義。
[0006]在人體組織中，骨髓中存在大量的MSCs，然而隨著年齡老化，自體骨髓中的MSCs 的數(shù)目會(huì)顯著降低、且增殖能力也會(huì)大幅衰退。同時(shí)，為保證自體或供體安全，對(duì)骨髓MSCs 的采集技術(shù)要求嚴(yán)格，配套儀器精密、成本高，不宜應(yīng)用推廣。因此，對(duì)于骨髓以外來源的研 宄越來越被重視。目前，不同的研宄已經(jīng)從圍產(chǎn)期的胎盤、臍帶、臍帶血，抽脂術(shù)來源的脂肪 以及流產(chǎn)胎兒中分離獲得增殖能力好、低免疫原性的MSCs。而這些組織中，臍帶屬于醫(yī)療廢 棄物，具有易于獲得、來源穩(wěn)定可控、無倫理爭議問題的特點(diǎn)，具有良好的研宄價(jià)值和應(yīng)用 前景。
[0007]目前對(duì)于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離的方法主要有貼壁法和酶消化法兩種。其中貼壁 法操作簡便，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求最低，是最易于推廣的方式。然而，獲得原代細(xì)胞周期長、不可 避免混雜部分內(nèi)皮細(xì)胞，需后期通過酶消化法進(jìn)一步進(jìn)行篩選，因此仍有待于進(jìn)一步改進(jìn)。 而酶消化法獲得較高純度的MSCs，但獲取的效率較低、單細(xì)胞貼壁能力弱、生長速度較慢。
[0008] 除了分離培養(yǎng)方法，MSCs培養(yǎng)基同樣對(duì)細(xì)胞獲得效率以及細(xì)胞質(zhì)量至關(guān)重要。在 目前已知來源中，MSCs含量極低，因此為獲得足夠數(shù)量的MSCs，不但需要對(duì)分離方法進(jìn)行 優(yōu)化，增加細(xì)胞得率，同時(shí)需要對(duì)獲得的MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增。含血清培養(yǎng)基雖 然可以在較短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增MSCs，但動(dòng)物血清所帶來的異源性污染可為臨床MSCs的應(yīng) 用帶來風(fēng)險(xiǎn)。因此，無血清培養(yǎng)基越來越受到關(guān)注。相比起來，無血清培養(yǎng)基成分確定，批 次穩(wěn)定，更容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)用中的安全性和可控性。但目前無血清培養(yǎng)基存在的普遍問題 在于對(duì)原代細(xì)胞的貼壁和生長支持能力不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的 方法。
[0010] 一種從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
[0011] 1)用含氨基青霉素和硫酸鏈霉素的PBS緩沖液對(duì)新生兒臍帶組織進(jìn)行充分的清 洗，去除污血；
[0012] 2)將臍帶進(jìn)行機(jī)械分離，得到剝離的華通氏膠；
[0013] 3)將華通氏膠輕微粉碎，加入膠原酶A，置于C02培養(yǎng)箱中消化處理；
[0014] 4)消化處理之后，進(jìn)行離心處理并收集細(xì)胞和殘余組織，利用PBS緩沖液洗去殘 留酶，再次進(jìn)行離心分離，棄去上層清液；
[0015] 5)將下層液進(jìn)行緩慢降溫，以每分鐘降低1°C的速率降低至2~6°C;
[0016] 6)加入胰酶，置于C02培養(yǎng)箱中消化處理，加入PBS緩沖液混勾，離心分離，棄去上 層清液；
[0017] 7)用培養(yǎng)基重懸組織和細(xì)胞，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于C0 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 然后離心分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液。
[0018] 優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，以所述用于培養(yǎng) 間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其包括以下成分組成：
[0019] a -MEM10. 3g/L、碳酸氫鈉2. 4g/L、碳酸鈉1. 8g/L、磷酸一氫鈉2. Og/L、磷酸二氫 鈉1. 6g/L、L-谷氨酰胺2-8mM、重組人白蛋白2-8g/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10-20mg/L、重組人 胰島素5-15mg/L、|3 -疏基乙醇50nM、谷胱甘肽0? l-3mg/L、對(duì)氨基苯甲酸0? 2-5mg/L、維生 素 B 25-40mg/L、維生素 C20-50mg/L、黃體酮 10-20ng/mL、腐胺 5-10mg/L、肝素 5-10IU/mL、 ￡6卩5-10耶/11^、13-?6?5-1〇1^/1^、1??5-1〇1^/1^、￥￡6?5-1〇1^/1^、脂質(zhì)0.1-111^/1、微量元素 l-10mg/L 及式 I 化合物 5-10 y M。
[0020] 優(yōu)選的，所述式I化合物的結(jié)構(gòu)式如下：
[0021]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 用含氨基青霉素和硫酸鏈霉素的PBS緩沖液對(duì)新生兒臍帶組織進(jìn)行充分的清洗，去 除污血； 2) 將臍帶進(jìn)行機(jī)械分離，得到剝離的華通氏膠； 3) 將華通氏膠輕微粉碎，加入膠原酶A，置于CO2培養(yǎng)箱中消化處理； 4) 消化處理之后，進(jìn)行離心處理并收集細(xì)胞和殘余組織，利用PBS緩沖液洗去殘留酶， 再次進(jìn)行離心分離，棄去上層清液； 5) 將下層液進(jìn)行緩慢降溫，以每分鐘降低1°C的速率降低至2~6°C ; 6) 加入胰酶，置于CO2培養(yǎng)箱中消化處理，加入PBS緩沖液混勻，離心分離，棄去上層清 液； 7) 用培養(yǎng)基重懸組織和細(xì)胞，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后 離心分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所 述培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，以所述用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血 清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其包括以下成分組成： α-ΜΗΜΙ 0. 3g/L、碳酸氫鈉2. 4g/L、碳酸鈉1.8g/L、磷酸一氫鈉2. Og/L、磷酸二氫鈉 1.6g/L、L-谷氨酰胺2-8mM、重組人白蛋白2-8g/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10-20mg/L、重組人胰 島素5-15mg/L、|3-疏基乙醇50nM、谷胱甘肽0.1-3mg/L、對(duì)氨基苯甲酸0.2_5mg/L、維生 素 B 25-40mg/L、維生素 C20-50mg/L、黃體酮 10-20ng/mL、腐胺 5-10mg/L、肝素 5-10IU/ mL、EGF5-10ng/mL、b-FGF5-10ng/mL、HGF5-10ng/mL、VEGF5-10ng/mL、脂質(zhì) 0· 1-lmg/L、微量 元素 l-10mg/L及式I化合物5-10 μ Μ。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所 述式I化合物的結(jié)構(gòu)式如下：
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所 述脂質(zhì)包括膽固醇、花生四烯酸、原兒茶酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻 酸中的一種或幾種的組合；所述微量元素包括Mg、Cu、Zn、Se、Fe、Sn、Ni、Ge、Zr、Rb、Co和 Mn中的任意一種或多種的混合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征 在于：在所述含氨基青霉素和硫酸鏈霉素的PBS緩沖液中，所述氨基青霉素和硫酸鏈霉素 的總質(zhì)量百分比濃度為1-6%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征 在于：在所述步驟3)中，所述膠原酶A的濃度為I. 5mg/mL-4. 5mg/mL，膠原酶A的添加量為 每15-20g的華通氏膠添加20mL，消化處理的時(shí)間為4-6小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征 在于：在所述步驟6)中，所述胰酶的濃度為0.03%-0.3%，添加量為每15-20g的華通氏膠 添加20mL，消化時(shí)間為20-25分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。該方法包括華通氏膠的分離、華通氏膠的消化、消化后液的離心分離、分離液的低溫處理、低溫處理后液的離心分離、培養(yǎng)等步驟。本發(fā)明所提供的從臍帶華通氏膠提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法是一種高效高純度獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，通過利用酶消化結(jié)合明膠鋪被提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的得率和純度，有效縮短分離獲得時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)快速制備和鑒定的方法，可獲得以往培養(yǎng)方法更高的得率。
【IPC分類】C12N5-0775
【公開號(hào)】CN104762256
【申請?zhí)枴緾N201510135941
【發(fā)明人】王銳峰
【申請人】湖北省生命源干細(xì)胞有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年3月26日