一種酶法制備低聚木糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶法制備低聚木糖的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 低聚木糖是功能性低聚糖的一種，是由2~10個(gè)木糖分子以0 -1，4-糖苷鍵連接 而成的低聚合度糖類，其有效成分為木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等，大部分產(chǎn)品以木二 糖和木三糖為主。低聚木糖與大豆低聚糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖等相比具有十分顯著的 優(yōu)勢(shì)，它可以選擇性地促進(jìn)腸道雙歧桿菌等有益菌的增殖活性。并且其雙歧因子功能是其 他聚合糖類的10-20倍。在自然界中，竹筍、水果、蔬菜等少數(shù)天然植物中含有少量的低聚 木糖，另外，一部分植物半纖維素在反芻動(dòng)物體內(nèi)也可以被部分分解為低聚木糖。
[0003] 低聚木糖很難被人體消化液如唾液、胃液、胰液等酶液所分解。因此它既不會(huì)增加 血糖濃度，也不會(huì)影響血糖中胰島素的水平，同時(shí)不會(huì)造成脂肪的堆積，故糖尿病人、肥胖 病人和低血糖病人均可放心食用。低聚木糖和其他低聚糖相比有良好的酸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定 性。即使在pH 2. 5~7. 0的酸性環(huán)境及加熱到100°C也基本不會(huì)分解。低聚木糖的儲(chǔ)存性 能很好，在37°C的條件下存放2個(gè)月幾乎不會(huì)被破壞而造成損失，并且粘度較低，操作使用 比較方便。因此低聚木糖被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、乳品飲料、飼料和食品等領(lǐng)域。
[0004] 目前低聚木糖是利用內(nèi)切木聚糖酶或重組菌產(chǎn)耐熱木聚糖酶定向水解來制得，并 得到一般以木二糖、木三糖為主的低聚木糖。內(nèi)切木聚糖酶能夠特異性降解木聚糖中的 0 -1，4-木糖苷鍵，其主要水解產(chǎn)物為低聚木糖系列，并伴隨著產(chǎn)生一些阿拉伯糖和木糖等 單糖，副產(chǎn)物較少，有利于后續(xù)工藝中低聚木糖的分離、提純和精制，所以該法是目前低聚 木糖生產(chǎn)的主要研宄方向。但木聚糖酶還存在一些缺點(diǎn)，如穩(wěn)定性差、使用效率低、半衰期 短等問題，使酶的生產(chǎn)和使用受到了極大的限制。內(nèi)切葡聚糖酶在由長(zhǎng)鏈纖維素降解成纖 維低聚糖的過程中發(fā)揮著重要的作用，其起作用的位置是纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨 機(jī)水解纖維素分子內(nèi)的0-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生短的纖維素鏈，暴露出新的纖維素末端。并與 外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶協(xié)同作用水解纖維素。目前未發(fā)現(xiàn)利用外源表達(dá)內(nèi)切葡聚 糖酶催化制備低聚木糖的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，通過基因工程的手段得到一種能夠?qū)⒛康拿福▋?nèi) 切葡聚糖酶EG I )分泌到菌體細(xì)胞外的工程酵母菌，并用其分泌的酶液代替內(nèi)切木聚糖 酶來制備低聚木糖。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 一種酶法制備低聚木糖的方法，其特征在于，將內(nèi)切葡聚糖酶EG I基因在巴斯德 畢赤酵母（Pichia Pastoris)中表達(dá)，得到的內(nèi)切葡聚糖酶EG I用于降解木聚糖制備低 聚木糖。
[0008] 其中，所述的內(nèi)切葡聚糖酶EG I基因來源于里氏木霉。
[0009] 一種酶法制備低聚木糖的方法，該方法包括如下步驟：
[0010] (1)構(gòu)建酵母工程菌：
[0011] (la)應(yīng)用PCR方法獲得里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶EG I基因；
[0012] (lb)將步驟（la)得到的內(nèi)切葡聚糖酶EG I基因插入pPICZa A質(zhì)粒中構(gòu)建重組 質(zhì)粒 pPICZaA-eg I;
[0013] (lc)將重組質(zhì)粒pPICZ a A-eg I轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，用Pme I線性化 后，電擊轉(zhuǎn)化入宿主菌巴斯德畢赤酵母中，得到酵母工程菌，該酵母工程菌已保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC NO. 9762,保藏日期為 2014年10月13日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編為100101，分類命 名：巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris);
[0014] (2)利用步驟（lc)得到的外源表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的酵母工程菌CGMCC NO. 9762 誘導(dǎo)表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGI;
[0015] (3)將步驟⑵得到的內(nèi)切葡聚糖酶EGI催化木聚糖解聚為低聚木糖。
[0016] 步驟⑵中，誘導(dǎo)表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG I的方法如下：將酵母工程菌CGMCC NO. 9762在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為2. 0~6. 0,離心棄上清，菌體用BMMY培養(yǎng)基重懸至 0D600為1.0,用甲醇誘導(dǎo)菌體產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶EG I。
[0017] 其中，甲醇誘導(dǎo)過程中維持甲醇的濃度為0. 05~0. lml/L，甲醇誘導(dǎo)濃度優(yōu)選為 0? lml/L〇
[0018] 其中，甲醇誘導(dǎo)的時(shí)間為96~120h，優(yōu)選誘導(dǎo)時(shí)間為120h。
[0019] 步驟（3)中，內(nèi)切葡聚糖酶EG I催化木聚糖解聚為低木聚糖的方法如下：向 10~100ml濃度為0. 05mol/L的檸檬酸緩沖液中加入內(nèi)切葡聚糖酶EG I與木聚糖，混合 均勻，調(diào)節(jié)pH值為4. 0~6. 0, pH優(yōu)選為4. 8;于30~50°C條件下酶解24~72h，酶解溫 度優(yōu)選為50°C，酶解時(shí)間優(yōu)選為36h。
[0020] 其中，內(nèi)切葡聚糖酶EG I與木聚糖的添加比例為5~50U:lg。
[0021] 有益效果：本發(fā)明使用構(gòu)建重組工程菌的方法，將內(nèi)切葡聚糖酶EG I通過穿梭 質(zhì)粒整合到能夠外源表達(dá)蛋白的畢赤酵母工程菌中，從而獲得能夠外源表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶 EG I的酵母工程菌，該酵母工程菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EG I，用表達(dá)的內(nèi)切 葡聚糖酶EG I酶液水解木聚糖制備低聚木糖。本發(fā)明為低聚木糖的制備提供了一個(gè)新方 法。
【附圖說明】
[0022] 圖1重組質(zhì)粒pPICZ a A-eg I的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023] 圖2以樺木為底物的低聚木糖酶解得率及隨著酶解時(shí)間增長(zhǎng)酶解液中低聚木糖 含量的變化趨勢(shì)圖，其實(shí)驗(yàn)條件為：〇. 〇2g/L的底物濃度，每g木聚糖酶添加酶40U，反應(yīng)體 系為50ml。
【具體實(shí)施方式】
[0024]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0025] 實(shí)施例1 :目的基因的獲得。
[0026] 根據(jù)NCBI上的里氏木霉的EG I基因（M15665. 1)設(shè)計(jì)引物用于獲得內(nèi)切葡聚糖 酶（EG I )基因（其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示），引物設(shè)計(jì)軟件采用Stratagene公 司的在線引物設(shè)計(jì)軟件QuikChange? Primer Design Program。選用EcoR I和Not I酶 切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)如下（下劃線為酶切位點(diǎn)）：
[0027] c.boipp.f(SEQ ID NO：2)5,-GAATTCATGGCGCCCTCAGTTACAC-3'
[0028] EcoR I
[0029] c. boitt. r(SEQ ID NO：3)5,-GCGGCCGCTCAACGCTCTAAAGGCAT-3'
[0030] Not I
[0031] 表1PCR反應(yīng)參數(shù)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酶法制備低聚木糖的方法，其特征在于，將內(nèi)切葡聚糖酶EGI基因在巴斯德 畢赤酵母（PichiaPastoris)中表達(dá)，得到的內(nèi)切葡聚糖酶EGI用于降解木聚糖制備低 聚木糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備低聚木糖的方法，其特征在于，所述的內(nèi)切葡聚糖 酶EGI基因來源于里氏木霉，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備低聚木糖的方法，其特征在于，該方法包括如下步 驟： (1) 構(gòu)建酵母工程菌： (la) 應(yīng)用PCR方法獲得里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶EGI基因； (lb) 將步驟（Ia)得到的內(nèi)切葡聚糖酶EGI基因插入pPICZaA質(zhì)粒中構(gòu)建重組質(zhì)粒 pPICZaA-egI； (lc) 將重組質(zhì)粒pPICZaA-egI轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，用PmeI線性化后，電 擊轉(zhuǎn)化入宿主菌巴斯德畢赤酵母中，得到酵母工程菌，該酵母工程菌已保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCCNO. 9762 ; (2) 利用步驟（Ic)得到的外源表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的酵母工程菌CGMCCNO. 9762誘導(dǎo)表 達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGI; (3) 將步驟（2)得到的內(nèi)切葡聚糖酶EGI催化木聚糖解聚為低聚木糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶法制備低聚木糖的方法，其特征在于，步驟（2)中，誘導(dǎo)表 達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGI的方法如下：將酵母工程菌CGMCCNO. 9762在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)至 0D600為2.O~6. 0,離心棄上清，菌體用BMMY培養(yǎng)基重懸至0D600為1. 0,用甲醇誘導(dǎo)菌體 產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶EGI。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的酶法制備低聚木糖的方法，其特征在于，甲醇誘導(dǎo)過程中維 持甲醇的濃度為〇. 05~0.lml/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的酶法制備低聚木糖的方法，其特征在于，甲醇誘導(dǎo)的時(shí)間為 96 ~120h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶法制備低聚木糖的方法，其特征在于，步驟（3)中，內(nèi)切葡 聚糖酶EGI催化木聚糖解聚為低木聚糖的方法如下：向10~100mL濃度為0. 05mol/L的 檸檬酸緩沖液中加入內(nèi)切葡聚糖酶EGI與木聚糖，混合均勻，調(diào)節(jié)pH值為4. 0~6. 0,于 30~50°C條件下酶解24~72h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的酶法制備低聚木糖的方法，其特征在于，內(nèi)切葡聚糖酶EGI 與木聚糖的添加比例為5~50U:lg。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法制備低聚木糖的方法，將內(nèi)切葡聚糖酶EGⅠ基因在巴斯德畢赤酵母(Pichia Pastoris)中表達(dá)，得到的內(nèi)切葡聚糖酶EGⅠ用于降解木聚糖制備低聚木糖。本發(fā)明構(gòu)建的酵母基因工程菌已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC NO.9762，保藏日期為2014年10月13日。利用該酵母基因工程菌表達(dá)得到的內(nèi)切葡聚糖酶EGⅠ酶解木聚糖，酶解36小時(shí)，低聚木糖得率達(dá)到68.12％。CGMCC NO.976220141013
【IPC分類】C12N15-81, C12N15-56, C12P19-14, C12R1-84, C12N9-42
【公開號(hào)】CN104762343
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510142708
【發(fā)明人】勇強(qiáng), 尹利旻, 楊磊, 李鑫, 賴晨歡, 徐勇, 歐陽嘉, 余世袁
【申請(qǐng)人】南京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年3月27日