一種miR-10b基因在胃癌診斷中的作用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種miR-10b基因在癌癥中的作用，具體涉及在胃癌診斷中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力是腫瘤治療的一大難點(diǎn)。近些年來(lái)，微小 RNA (microRNA，miRNA)的出現(xiàn)為研宄腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的思路和途徑， 微小RNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性、保守、穩(wěn)定的非編碼短單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因 表達(dá)miRNA在機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生發(fā)展等生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作 用，成為當(dāng)前生命科學(xué)研宄的熱點(diǎn)。miRNA(microRNA)是廣泛存在于生物體內(nèi)的19-25nt的 非編碼單鏈小分子RNA，其通過(guò)與靶基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)降解靶mRNA或抑制其翻譯。研 宄表明miRNA在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起重要作用，miRNA很有可能成為癌癥治療與診斷的新途 徑。miRNA與靶基因mRNA的非編碼序列（3' -UTR或5' -UTR)存在著一對(duì)多的關(guān)系。在 癌癥病例中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)miRNA群表達(dá)失調(diào)的現(xiàn)象，而這些miRNA表達(dá)的改變與癌癥發(fā)生密切 相關(guān)。在體外實(shí)驗(yàn)中，改變一個(gè)或者多個(gè)miRNA的表達(dá)能夠促進(jìn)或者抑制癌細(xì)胞惡化，促進(jìn) 癌細(xì)胞惡化的miRNA可以認(rèn)為是一類(lèi)癌基因，反之，抑癌基因。miR-10b作為微小RNA家族 中的一員，在肝癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、垂體瘤、急性髓性白血病等腫瘤組織中都有異 常表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。
[0003]胃癌在我國(guó)各種惡性腫瘤中居首位，胃癌發(fā)病有明顯的地域性差別，在我國(guó)的西 北與東部沿海地區(qū)胃癌發(fā)病率比南方地區(qū)明顯為高。好發(fā)年齡在50歲以上，男女發(fā)病率 之比為2:1。胃癌的預(yù)后與胃癌的病理分期、部位、組織類(lèi)型、生物學(xué)行為以及治療措施有 關(guān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，2008年全球范圍內(nèi)大約100萬(wàn)胃癌新發(fā)病例，占全部腫瘤發(fā)病 的7. 8%，僅次于肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌。超過(guò)70%的胃癌病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，其中 50%發(fā)生在中國(guó)。在我國(guó)，胃癌年齡標(biāo)化發(fā)病率男性為41. 3/10萬(wàn)，女性為18. 5/10萬(wàn)，僅 次于肺癌。大約90% -95%的胃癌為腺癌，起源于胃部上皮組織。
[0004] 目前，除了影像學(xué)檢查和內(nèi)鏡檢查之外，生物大分子腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)也可用 于胃癌的診斷。臨床上常用的生物大分子腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA)、糖蛋白類(lèi)抗原 (CA19-9、CA125)能提高體內(nèi)惡性腫瘤特別是胃腸道惡性腫瘤的檢出率，但這些標(biāo)志物并不 能做到早期高靈敏度、高特異性地診斷胃癌。由于體內(nèi)各器官分化來(lái)源、腫瘤的成瘤原因以 及腫瘤分泌的腫瘤因子均不相同，因此要特異性地、高靈敏地早期檢測(cè)出某一種特定腫瘤， 仍是一項(xiàng)很龐大的課題。
[0005] 由此可見(jiàn)，目前迫切需要尋找具有高特異性和有效性的胃癌診斷標(biāo)志物，并開(kāi)發(fā) 能夠靶向作用于胃癌，減少對(duì)正常組織與人體的傷害的新藥物。本發(fā)明擬在研宄miR-10b 基因在胃癌診斷中的應(yīng)用，利用miRNA為胃癌診斷方面提供了一定的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明可 為胃癌的診斷和預(yù)后提供有利的技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中上述缺陷，提供一種miR-10b基因在胃癌 診斷中的應(yīng)用。具體是提供了血漿miR-10b檢測(cè)在癌癥患者診斷中的用途，特別是血漿 miR-10b檢測(cè)與CA742聯(lián)合檢測(cè)在癌癥患者診斷中的用途，其中癌癥細(xì)胞主要為胃癌細(xì) 胞，其中所述miR-10b在胃癌患者血漿中的特異性表達(dá)上調(diào)。本發(fā)明還提供了一種組織 miR-10b檢測(cè)在癌癥患者診斷中的用途，所述組織miR-10b檢測(cè)過(guò)程中，特異性表達(dá)上調(diào) miR-10b均能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移能力；miR-10b在胃癌組織中表達(dá)與胃癌患 者的腫瘤大小，腫瘤原發(fā)位置，腫瘤侵入深度和腫瘤細(xì)胞惡性程度密切相關(guān)。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)以下具體方法，研宄miR-10b靶基因，具體為：
[0008] A:Transwell驗(yàn)證胃癌細(xì)胞中miR-10b的表達(dá)與其侵襲、迀移能力的相關(guān)性；
[0009] A.動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)闡明miR-10b在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用
[0010] a)培養(yǎng)穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-10b過(guò)表達(dá)/缺失表達(dá)胃癌細(xì)胞，皮下接種裸鼠；
[0011] b)觀察接種細(xì)胞后的小鼠體內(nèi)細(xì)胞成瘤情況及腫瘤轉(zhuǎn)移情況；
[0012] C)探討miR-10b在胃癌轉(zhuǎn)移、侵襲中的調(diào)控作用；
[0013] B. miR-10b的組織學(xué)及血液學(xué)臨床研宄評(píng)價(jià)其作為胃癌診斷、治療標(biāo)志物的可行 性；
[0014] a)收集胃癌患者癌組織及癌旁配對(duì)組織；
[0015] b)收集胃癌手術(shù)患者術(shù)前、術(shù)后和復(fù)發(fā)后外周血及非癌對(duì)照外周血血漿樣本；
[0016] c)提取組織和血衆(zhòng)中microRNA ;
[0017] d) Real-time PCR檢測(cè)胃癌組織及癌旁配對(duì)組織中miR-10b表達(dá)并分析其臨床意 義；
[0018] e) Real-time PCR檢測(cè)游離血漿中miR-10b的表達(dá)并探討其臨床意義；
[0019] f)評(píng)估m(xù)iR-10b作為胃癌診斷和治療標(biāo)志物的可行性。
[0020] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-10b在體內(nèi)、體外均能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移 能力；miR-10b在胃癌組織中表達(dá)與胃癌患者的腫瘤大小，腫瘤原發(fā)位置，腫瘤侵入深度和 腫瘤細(xì)胞惡性程度密切相關(guān)。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)血漿miR-10b檢測(cè)可以用于癌癥患者診斷，血 漿miR-1 Ob檢測(cè)和CA742檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用可以用于癌癥患者的診斷。本發(fā)明利用miRNA為胃 癌診斷方面提供了一定的應(yīng)用價(jià)值，為胃癌的診斷和預(yù)后提供有利的技術(shù)支持。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1. Real time RT-PCR檢測(cè)不同人胃癌細(xì)胞中miR-10b的表達(dá)水平；
[0022] 圖2.上調(diào)miR-10b表達(dá)水平促進(jìn)了 AGS細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力；
[0023] 圖3.過(guò)表達(dá)miR-10b細(xì)胞注射小鼠后的腫瘤生長(zhǎng)體積曲線圖；
[0024] 圖4. miR-10b在胃癌組織中的表達(dá)分布；
[0025] 圖5. R0C曲線分析miR-10b，CA724和聯(lián)合治標(biāo)Y的診斷價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
[0027] A. miR-10b在胃癌中表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的探討。
[0028] a) miR-10b在不同胃癌細(xì)胞和正常胃粘膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平的檢測(cè)
[0029] 同時(shí)復(fù)蘇、培養(yǎng)不同分化、不同轉(zhuǎn)移能力的胃癌細(xì)胞株BGC-803、MGC-803、AGS、 BGC-823、MKN-45、SGC-7901、HGC-27和胃正常上皮細(xì)胞株GES-1。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期，提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中miR-10b的表達(dá)。如圖1所示， 在不同細(xì)胞系中miR-10b的表達(dá)水平存在較大差異。MiR-lOB在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)與 GES-1 細(xì)胞比較，在 BGC-803 (8. 6-fold)，MGC-803 (11. 8-fold)，AGS(30. 9-fold)，BGC-823 (56. 1-fold)，MKN-45 (65. 2-fold)，SGC-7901 (84. 1-fold) and HGC-27 (225. 7-fold)中依 次升高（圖1)，且此升高與腫瘤細(xì)胞的分化程度和細(xì)胞是否衍生于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān) (P<0. 05, p<0. 001)
[0030] b)miR-10b的表達(dá)與胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性
[0031] 將構(gòu)建完成的慢病毒miR-10b過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞 株，通過(guò)劃痕法和transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化。與Scramble細(xì)胞相比， miR-10b表達(dá)水平的上調(diào)使AGS細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力上升了各約1. 6倍和2倍（圖2A， 2B) 〇
[0032] c)動(dòng)物模型闡明miR-10b在胃癌轉(zhuǎn)移侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用；
[0033] 40 只（AGS-NC 組（Scramble)20 只，AGS-miR-10b 組（miR-10b mimic)20 只）4-6 周齡雄性BALB/c裸小鼠，體重20±2g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)： SCXK(滬）2007-0005。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1X10 7個(gè)/mL制備單細(xì)胞懸液，0. 2ml/ 只接種于裸小鼠右側(cè)腋窩皮下。接種后開(kāi)始測(cè)量腫瘤瘤徑，用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的最長(zhǎng)徑 (a)和最短徑（b)，計(jì)算腫瘤的體積（V)，V(cm3) = 1/6 Jr ab2 = 0. 5236ab2 ;腫瘤指數(shù)（mg/ g)=腫瘤體質(zhì)量（mg)/小鼠體質(zhì)量（g)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，采用斷頸法處死裸鼠，尸解觀察肝、肺 腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。
[0034] 動(dòng)物成瘤及生長(zhǎng)情況：本實(shí)驗(yàn)40只裸鼠均能成瘤，接種瘤塊5~6天，均可見(jiàn)直徑 約3~4_的瘤樣結(jié)節(jié)，質(zhì)地軟。連續(xù)觀察20天，瘤性結(jié)節(jié)漸硬，這期間兩組裸鼠腫瘤體積 增大明顯。8W后處死裸鼠，尸解觀察肝、肺腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。
[0035] 研宄結(jié)果顯示，miR-10b過(guò)表達(dá)載體組的腫瘤體積有顯著增加，在致瘤12d，15d， 18d，和21d與Scramble組比較，均有顯著的差異（均P〈0. 05,表1，圖3)。
[0036]表1過(guò)表達(dá)miR-10b細(xì)胞注射小鼠對(duì)腫瘤體積的影響（孓士s，n = 20)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 血衆(zhòng)miR-lOb檢測(cè)在癌癥患者診斷中的用途。
2. 血漿miR-lOb檢測(cè)與CA742聯(lián)合檢測(cè)在癌癥患者診斷中的用途。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述用途，其中癌癥細(xì)胞主要為胃癌細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述用途，其中所述miR-lOb在胃癌患者血漿中的特異性表 達(dá)上調(diào)。
5. 組織miR-lOb檢測(cè)在癌癥患者診斷中的用途。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5中所述用途，其中癌癥細(xì)胞主要為胃癌細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5中所述用途，所述組織miR-lOb檢測(cè)過(guò)程中，特異性表達(dá)上調(diào) miR-lOb均能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移能力。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5中所述用途，其中miR-lOb在胃癌組織中表達(dá)與胃癌患者的腫瘤大 小，腫瘤原發(fā)位置，腫瘤侵入深度和腫瘤細(xì)胞惡性程度密切相關(guān)。
9. 一種研宄miR-lOb作為胃癌診斷、治療標(biāo)志物的方法， 收集胃癌患者癌組織及癌旁配對(duì)組織； 收集胃癌手術(shù)患者術(shù)前、術(shù)后和復(fù)發(fā)后外周血及非癌對(duì)照外周血血漿樣本； 提取組織和血漿中microRNA; Real-timePCR檢測(cè)胃癌組織及癌旁配對(duì)組織中miR-lOb表達(dá)并分析其臨床意義；Real-timePCR檢測(cè)游離血漿中miR-lOb的表達(dá)并探討其臨床意義； 評(píng)估m(xù)iR-10b作為胃癌診斷和治療標(biāo)志物的可行性。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種miR-10b基因在胃癌診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-10b在體內(nèi)、體外均能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移能力；miR-10b在胃癌組織中表達(dá)與胃癌患者的腫瘤大小，腫瘤原發(fā)位置，腫瘤侵入深度和腫瘤細(xì)胞惡性程度密切相關(guān)。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)血漿miR-10b檢測(cè)可以用于癌癥患者診斷，血漿miR-10b檢測(cè)和CA742檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用可以用于癌癥患者的診斷。本發(fā)明利用miRNA為胃癌診斷方面提供了一定的應(yīng)用價(jià)值，為胃癌的診斷和預(yù)后提供有利的技術(shù)支持。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104762372
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510030094
【發(fā)明人】姚行, 馬志紅, 戴利成
【申請(qǐng)人】湖州市中心醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年1月21日