流感病毒通用核酸檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域;具體說來,本發(fā)明確立了一群重要病毒(即流感病毒)的通用檢測方法,用于甲、乙、丙等三個型的流感病毒以及新發(fā)現(xiàn)的一些流感病毒的檢測,在科學研宄、醫(yī)學臨床診斷和獸醫(yī)臨床診斷上有較大的使用價值。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]流感病毒是人、禽、馬、豬等動物重要的病原,可以分為甲、乙、丙三個型。甲型流感病毒還可以分為H1N1、H3N2、H5N8、H9N2等亞型。最近,從牛體內(nèi)分離到的流感病毒與甲、乙、丙三個型的流感病毒都有顯著不同,因此可以當作一個新型的流感病毒。
[0004]病毒核酸檢測是病毒檢測重要方法之一。目前,國內(nèi)外對流感病毒的各種核酸檢測方法都是僅針對一個型或一個亞型的流感病毒,沒有針對所有型的流感病毒的通用核酸檢測方法。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明針對上述現(xiàn)有流感病毒檢測技術(shù)的不足,開展了深入研宄和測試,建立了甲、乙、丙等三個型的流感病毒以及新發(fā)現(xiàn)的一些流感病毒通用核酸檢測方法。該方法包括以下三個方面內(nèi)容:
(一)確立了核酸檢測所需要的引物序列,針對流感病毒PBl等基因中保守區(qū)域,設(shè)計引物序列,其中上游引物序列含有20個堿基,序列為ccagttggwggtaatgaaaa(即序列表中SEQID N0.1,其中w是簡并堿基,表示堿基a和堿基t的混合物),下游上游引物序列含有26個堿基,序列為gttgacagcatgttraacatkcccat(即序列表中SEQ ID N0.2,其中r是簡并堿基,表示堿基g和堿基a的混合物,k也是簡并堿基,表示堿基g和堿基t的混合物);
(二)確立了檢測反應(yīng)種類,可以采用多種檢測反應(yīng),包括普通的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(通常,這類反應(yīng)產(chǎn)物用核酸電泳進行檢測)、熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(通常,這類反應(yīng)產(chǎn)物用熒光物質(zhì)進行檢測)或依賴核酸序列擴增反應(yīng)(通常,這類反應(yīng)產(chǎn)物用電化學發(fā)光物質(zhì)進行檢測);目前,普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)和熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)最有推廣價值。
[0007](三)確立了檢測反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,以普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)為例,在聚合酶鏈式反應(yīng)管中依次加入純水7.5微升、2倍一步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)緩沖液12.5微升(含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四種核苷酸)、一步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)所需要的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸聚合酶的混合物I微升、第一步所合成的上游引物I微升(濃度為10微摩爾每升)、第一步所合成的下游引物I微升(濃度為10微摩爾每升)、需要檢測的流感病毒核酸2微升(從臨床樣品或其他樣品中用核酸提取試劑盒提取的);然后將逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)體系密閉,置于聚合酶鏈式反應(yīng)儀器(國內(nèi)常稱為PCR儀)上進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng),反應(yīng)條件為42攝氏度30分鐘,然后94攝氏度2分鐘,再進行40個循環(huán),每個循環(huán)為94攝氏度30秒,55攝氏度30秒,72攝氏度30秒,循環(huán)結(jié)束后72攝氏度延伸5至10分鐘;反應(yīng)結(jié)束后,在反應(yīng)產(chǎn)物中加入含有顏色的核酸電泳緩沖液,進行瓊脂糖核酸凝膠電泳,如果出現(xiàn)大小約為430至480個堿基對的核酸電泳條帶,則判斷為陽性,否則判斷為陰性。
[0008]
【具體實施方式】
[0009]下面通過實施例,說明本發(fā)明的技術(shù)方案,但本發(fā)明的保護范圍不限于這個實施例。
[0010]本實施例用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng),對流感病毒進行通用核酸檢測,包括如下步驟:
第一步(合成引物):按照本發(fā)明指定的核酸序列(即序列表中SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2),人工合成逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)所需要的上游引物和下游引物;
第二步(配置逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)體系):在聚合酶鏈式反應(yīng)管中依次加入純水7.5微升、2倍一步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)緩沖液12.5微升(含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四種核苷酸)、一步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)所需要的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸聚合酶的混合物I微升、第一步所合成的上游引物I微升(濃度為10微摩爾每升)、第一步所合成的下游引物I微升(濃度為10微摩爾每升)、需要檢測的流感病毒核酸2微升(從臨床樣品或其他樣品中用核酸提取試劑盒提取的);
第三步(進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)):將第二步配置好的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)體系密閉后,置于聚合酶鏈式反應(yīng)儀器(國內(nèi)常稱為PCR儀)上進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng),反應(yīng)條件為42攝氏度30分鐘,然后94攝氏度2分鐘,再進行40個循環(huán),每個循環(huán)為94攝氏度30秒,55攝氏度30秒,72攝氏度30秒,循環(huán)結(jié)束后72攝氏度延伸5至10分鐘;第四步(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)結(jié)果檢測):在第三步的反應(yīng)產(chǎn)物中加入含有顏色的核酸電泳緩沖液,進行瓊脂糖核酸凝膠電泳,如果出現(xiàn)大小約為430至480個堿基對的核酸電泳條帶,則判斷為陽性,否則判斷為陰性。
[0011]實際應(yīng)用結(jié)果:對98份人甲型流感病毒標準陽性臨床樣品、對46份人乙型流感病毒標準陽性臨床樣品、128份禽甲型流感病毒標準陽性臨床樣品、3份牛流感病毒標準陽性臨床樣品進行檢測,以及300份來自禽和人的標準陰性樣品,用上述流感病毒通用核酸檢測技術(shù)進行檢測,結(jié)果顯示該技術(shù)的靈敏度為99.27%,特異性為99.33%。
【主權(quán)項】
1.流感病毒通用的核酸檢測技術(shù),可采用普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)、熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)、依賴核酸序列擴增反應(yīng)等檢測反應(yīng),其特征是可以檢出甲、乙、丙等三個型的流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的流感病毒,至少可以檢出甲型和乙型流感病毒。
2.流感病毒通用的核酸檢測技術(shù),其特征有兩個:一是可以檢出甲、乙、丙等三個型的流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的流感病毒,至少可以檢出甲型和乙型流感病毒;二是采用普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)或熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)。
3.流感病毒通用的核酸檢測技術(shù),其特征有三個:一是可以檢出甲、乙、丙等三個型的流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的流感病毒,至少可以檢出甲型和乙型流感病毒;二是采用針對流感病毒PBl基因保守的區(qū)域而設(shè)計的一對引物;三是采用普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)或熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)。
4.流感病毒通用的核酸檢測技術(shù),可采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)、熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)、依賴核酸序列擴增反應(yīng)等檢測反應(yīng),其特征有兩個:一是可以檢出甲、乙、丙等三個型的流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的流感病毒,至少可以檢出甲型和乙型流感病毒;二是檢測反應(yīng)采用的一條引物的序列為ccagttggwggtaatgaaaa,或與ccagttggwggtaatgaaaa序列有10個或10個以上的堿基序列相同的序列(本段文字中,引物序列均為5撇端至3撇端,a、t、g、c表示相應(yīng)的堿基,w代表簡并堿基,表示堿基a和堿基t的混合物)。
5.流感病毒通用的核酸檢測技術(shù),可采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)、熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)、依賴核酸序列擴增反應(yīng)等檢測反應(yīng),其特征有兩個:一是可以檢出甲、乙、丙等三個型的流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的流感病毒,至少可以檢出甲型和乙型流感病毒;二是檢測反應(yīng)采用的一條引物的序列為gttgacagcatgttraacatkcccat,或與gttgacagcatgttraacatkcccat序列有10個或10個以上的堿基序列相同的序列(本段文字中,引物序列均為5撇端至3撇端,a、t、g、c表示相應(yīng)的堿基,r和k代表簡并堿基,r表示堿基g和堿基a的混合物,k表示堿基g和堿基t的混合物)。
6.流感病毒通用的核酸檢測技術(shù),其特征有三個:一是采用普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)或熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng);二是檢測反應(yīng)采用的兩條引物,其序列分別為ccagttggwggtaatgaaaa 矛口 gttgacagcatgttraacatkcccat,10 10以上的堿基序列相同的序列(本段文字中,引物序列均為5撇端至3撇端,a、t、g、c表示相應(yīng)的堿基,w、r和k代表簡并堿基,w表示堿基a和堿基t的混合物,r表示堿基g和堿基a的混合物,k表示堿基g和堿基t的混合物)。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,它確立了甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的一些流感病毒的通用核酸檢測方法,含有三個技術(shù)要點: 確立了核酸檢測所需要的引物序列;確立了檢測反應(yīng)種類;確立了檢測反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。該通用核酸檢測方法可以用于流感病毒科學研究,也可以用于動物或人的臨床診斷檢測。
【IPC分類】C12Q1-70, C12Q1-68
【公開號】CN104762413
【申請?zhí)枴緾N201510000953
【發(fā)明人】陳繼明, 王素春
【申請人】中國動物衛(wèi)生與流行病學中心
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年1月4日