一種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物選擇性分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及贍餘二帰內(nèi)醋類化合物的分離純化，具體地說是一種反相色譜采用帶 正電荷的X化argeC18柱在低抑條件下高選擇性地分離純化贍餘二帰內(nèi)醋類化合物的新 方法。該方法對(duì)氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋類化合物和非氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋類化 合物表現(xiàn)出較優(yōu)的分離效果。
【背景技術(shù)】
[0002] 贍餘二帰內(nèi)醋（bufadienolides)是一類C24留，并且在留體母核的C17位接有 目六元不飽和內(nèi)醋環(huán)，該類化合物也常被稱為贍餘二帰內(nèi)醋。Liselotte.Krenn,Pieter S.Steyn和高慧敏等分別對(duì)贍餘二帰內(nèi)醋合物具有的生物活性進(jìn)行了綜述。該些活 性主要包括局麻、強(qiáng)也、升壓、Na7K+-ATP酶抑制活性及抗腫瘤等作用（L.Krenn，B. Kopp,Bufadienolidesfromanimalandplantsources,Phytochemistry, 48(1998) 1-29. ；P.S.Steyn,FanieR.vanHeerden,Bufadienolidesofplantandanimalorigin,Nat. Prod.Rep, 15 (1998) 397-413. ；H.Gao,R.Popescu,B.Kopp,Z.Wang,Bufadienolidesand theirantitumoractivity,P'Jat.Prod.Rep.,28(2011)953-969.)。另外，此類贍餘二帰內(nèi) 類成分中的許多化合物都具有較高的毒性和較嚴(yán)重的副作用，從而制約了此類制劑的使用 (D.Wang,F.Qi,W.Tang,F.Wang,ChemicalConstituentsandBioactivitiesoftheSkin ofBufobufogargarizansCantor,Qiem.Biodivers. ,8(2011)559-567.)。并對(duì)使用者帶 來一定的安全隱患。從天然產(chǎn)物(贍餘皮、贍酥）中分離純化是獲得贍餘二帰內(nèi)醋單體的主 要途徑。由于贍餘二帰內(nèi)醋類化合物數(shù)量多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，常規(guī)的分離純化方法較為耗時(shí)、低 效（L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolidesfromanimalandplantsources,Phytochemistry ，48(1998) 1-29.)。然而，由于此類化合物的本身的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和數(shù)目的繁多，關(guān)于此類化合 物的藥效理，目前的認(rèn)識(shí)還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。因此，采用較為系統(tǒng)的高效的方法從贍餘皮中分 離出高純度的贍餘二帰內(nèi)醋類化合進(jìn)而開展相關(guān)藥理毒理方面的研究是十分迫切的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明涉及一種贍餘二帰內(nèi)醋類化合物選擇性分離純化方法。
[0004] 基于低抑值條件下，氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋類化合物和非氨基酸修飾的 贍餘二帰內(nèi)醋類化合物的離子性質(zhì)的不同，我們采用帶正電荷的X化argeC18柱發(fā)展了 一種新型的高選擇性的高效液相色譜法。流動(dòng)相組成為己膳、甲醇、己醇、甲酸、己酸、H 氣己酸、水，無緩沖鹽添加，便于樣品制備后處理。其中所述的帶正電荷的柱子為混合模 式柱（X化argeC18,北京華譜新創(chuàng)科技有限公司）。色譜操作參數(shù)如下；色譜柱內(nèi)徑為 4. 6-lOOmm;樣品濃度為lmg/mL-1-lg/mL;進(jìn)樣量為1y心40血；流速為1-480血/min;柱溫 為10-6(TC。所述流動(dòng)相組成為己膳-酸-水、甲醇-酸-水、己醇-酸-水；其中酸可W 是W下酸中的一種或幾種：甲酸、己酸、丙酸、H氣己酸。在該純化體系中從贍餘皮提取物中 制備獲得兩組八個(gè)贍餘二帰內(nèi)醋化合物。所述化合物的結(jié)構(gòu)信息見式1、表1。
[0(in引
[0006] 式1氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋（1-4)和非氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋（5-8)的 結(jié)構(gòu)式
[0007] 表1純化制得的8個(gè)贍餘二帰內(nèi)醋類化合物信息
[000引
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物選擇性分離的純化方法，其特征在于： 1) 蟾蜍皮乙醇提取物先經(jīng)制備型RPLC分離，水（A)和甲醇（B)流動(dòng)相體系；洗脫梯度 為體積濃度25% - 100%B(V/V);按各色譜峰的保留時(shí)間分別收集各餾分，每個(gè)組分濃縮至 干后備用； 2) 針對(duì)富含蟾蜍二烯內(nèi)酯的組分F13,分離過程中F13組分對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相中甲醇的體 積濃度為57%-58. 3%，采用半制備反相色譜進(jìn)行進(jìn)純化制備，色譜柱為XChargeC18柱；采 用乙腈-酸水溶液、甲醇-酸水溶液或乙醇-酸水溶液流動(dòng)相體系，對(duì)F13進(jìn)行選擇性地分 離和化合物制備。
2. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：反相色譜柱為極性 共聚的帶正電荷的混合模式柱（XChargeC18);采用線性梯度、臺(tái)階梯度或等度洗脫方式， 對(duì)氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物和非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物進(jìn)行選 擇性分離和純化。
3. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：色譜操作參數(shù)如下： 色譜柱內(nèi)徑為4. 6-100mm ;采用體積濃度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上 樣濃度為 lmg/mL-i-lg/mL ;進(jìn)樣量為 I ii L-40mL ;流速為 l-480mL/min ;柱溫為 10-60°C。
4. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：所述流動(dòng)相中酸可 以是以下酸中的一種或二種以上：甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸，無緩沖鹽添加，便于樣品制 備后處理，所述酸水溶液中酸的體積濃度為0.l%-〇. 5% (V/V)。
5. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：所述蟾蜍皮提取物 為50%-95% (V/V)乙醇回流提取物。
6. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于： 1) 蟾蜍皮50%-95% (V/V)乙醇提取物先經(jīng)制備型RPLC分離，色譜條件：色譜 柱為碳十八柱（C18TDE柱）；水（A)和甲醇（B)流動(dòng)相體系；洗脫梯度為0-7min， 體積濃度25% - 40%B; 7-60min,體積濃度40% - 65%B; 60-65min,體積濃度 65% - 100%B;65-75min, 100%B;流速為330mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm;其采用體積濃度 65%-80%甲醇-水溶解，樣品溶液濃度為440mg/mL;進(jìn)樣體積為40mL;按各色譜峰的保留時(shí) 間分別收集各餾分，共計(jì)22個(gè)組分，每個(gè)組分濃縮至干后備用；針對(duì)F13(分離過程中F13組 分對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相中甲醇的體積濃度為57%-58. 3%)，采用半制備反相色譜進(jìn)行進(jìn)純化制備， 色譜柱為XChargeC18柱；采用乙腈-酸水流動(dòng)相體系，采用線性梯度洗脫方式制備蟾蜍二 烯內(nèi)酯單體化合物； 2) 選取組分F13采用半制備反相色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離，色譜條件：色譜柱為帶正電荷 的混合模式色譜柱（XChargeC18, 250X20mm，i.d.，5iim);體積濃度0. 1%甲酸水（A)和乙 腈（B)流動(dòng)相體系；流速為19mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm;進(jìn)樣量為2mL;按各色譜峰的保 留時(shí)間分別收集各餾分，分別回收溶劑，經(jīng)核磁實(shí)驗(yàn)確定，獲得1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8八個(gè)化合 物； 通過反相色譜制備獲得兩類八個(gè)高純度蟾蜍二烯內(nèi)酯化合物；所述兩類化合物分別為 4個(gè)氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物：化合物1為異沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化 合物2為去乙酰華蟾毒它靈-3-庚二酰精氨酸酯，化合物3為沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸 酯，化合物4為遠(yuǎn)華蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯；4個(gè)非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯：化合
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物選擇性分離純化方法?；诘蚿H值條件下，氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物和非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的離子性質(zhì)的不同，我們采用帶正電荷的XCharge C18柱發(fā)展了一種新型的高選擇性的高效液相色譜分離方法。流動(dòng)相無緩沖鹽添加，便于樣品制備后處理。選取蟾蜍皮95%乙醇提取物反相色譜制備分離所得的一個(gè)餾分，通過反相色譜制備獲得兩類共八個(gè)化合物。該方法可以實(shí)現(xiàn)氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類、非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類的高效制備，特別是對(duì)氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類，該方法解決了拖尾問題，并表現(xiàn)出的較好的峰形和優(yōu)異分離效果。從而提供了一種高效系統(tǒng)分離蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的新方法，為該類化合物的抗癌活性研究和單一成分的新藥開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
【IPC分類】C07J71-00, C07J41-00, C07J19-00
【公開號(hào)】CN104774234
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410009557
【發(fā)明人】李曉龍, 梁鑫淼, 劉艷芳, 張?jiān)? 張秀莉, 薛興亞
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2014年1月9日