可樂定半抗原、抗原及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可樂定半抗原、抗原、單克隆抗體制備方法及其應用，屬于生物化 工領域。
【背景技術】
[0002] 可樂定（(：1〇111乜1^)化學名稱為2-[(2,6-二氯苯基)亞氨基]咪唑烷鹽酸鹽，別 名可樂寧，氯壓定，催壓降，血壓得平，110降壓片，可樂亭，壓泰生，英文別名2, 6-dichloro -N-(2-imidazolin_2-yl)aniline。分子式C9H9C12N3 ;分子量：230. 1?？蓸范榘咨Y晶性 粉末；無臭。在水中或乙醇中溶解，在氯仿中極微溶解，在乙醚中幾乎不溶，熔點為305°C。 可樂定是一種抗高血壓藥物，其藥理作用主要為通過刺激腦干a2-腎上腺受體導致交感 神經(jīng)從中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳出減少，從而降低外周阻力、腎血管阻力、心率以及血壓?？蓸范?口服吸收迅速，約50%在肝臟代謝，代謝物為對羥基可樂定和葡萄糖醛酸酯，對羥基可樂定 不能通過血腦屏障，無降壓活性；20%~40%以原型和代謝物的形式從尿中排出；約20%從 糞便中排出。自2006年起在國內(nèi)的飼料產(chǎn)品中已發(fā)現(xiàn)有添加的趨勢，分析其作用機理應與 瘦肉精等0受體激動劑類似，以提高飼料轉化率達到增重的效果。2010年4月23日北京 市懷柔區(qū)的北京水岸山吧餐飲有限責任公司發(fā)生的急性集體可樂定中毒事件已經(jīng)引起全 社會的高度重視。目前，可樂定對動物促生長及增重的作用已有文獻報道，在國內(nèi)已發(fā)現(xiàn) 將這種藥物違法添加在豬飼料中，2010年12月農(nóng)業(yè)部1519號公告已明確把可樂定列入了 《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質》清單，世界衛(wèi)生組織、美國、歐盟及一些發(fā)達國家等 都禁止違法使用可樂定。其常見的副作用有口干、瞌睡、頭暈、鎮(zhèn)靜、呼吸抑制等。食用含有 可樂定殘留的動物源性產(chǎn)品，對人體健康具有一定的危害性，對兒童的作用更為明顯。
[0003]目前國內(nèi)外大多采用高效液相色譜法、氣相色譜法測定，這些方法特異性強、靈敏 度高、但是樣品前處理操作步驟繁瑣，成本較高，也不適用于大批量樣品的篩選檢測。免疫 化學分析由于在抗原抗體的定性定量方面獨特的優(yōu)勢和操作簡便快速、成本低、靈敏度較 高、分析樣本量大的優(yōu)點彌補了理化分析的不足?？蓸范ㄈ斯た乖闹苽錇檫@一方法的實 施奠定了重要基礎。影響免疫化學分析質量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性 質又決定于免疫半抗原分子的結構，因此免疫半抗原的分子設計與合成就是產(chǎn)生特異性抗 體和建立小分子獸藥殘留快速檢測技術的最基礎和最關鍵的步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種可樂定人工抗原及其制備方法與應用。
[0005] 本發(fā)明所提供的可樂定人工抗原，是將可樂定半抗原與載體蛋白偶聯(lián)獲得的抗 原。
[0006] 可樂定半抗原是一種化合物，其結構為式I所示。
【主權項】
1. 一種可樂定半抗原，為式I所示產(chǎn)物： 式I。
2. 式I所示產(chǎn)物的制備方法，包括如下步驟： 將lOOmg阿可樂定和49mg己酵酸溶于己醇中，室溫攬拌16h，減壓濃縮； 使用制備薄層色譜分離純化，展開劑二氯甲焼；甲醇（V/V) =5:1，得白色固體CLD-EC0。
3. -種可樂定抗原，是將式I所示產(chǎn)物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。
4. 權利要求3所述可樂定抗原的制備方法，包括如下步驟： (1) 取式I所示產(chǎn)物13mg，溶解于2mL二甲基甲醜胺中，磁力攬拌使其充分溶解； (2) 取步驟1溶液，加入17mg1-己基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（邸C)和 15mgN-羥基玻巧醜亞胺（N服），室溫活化反應化； (3) 稱取載體蛋白50mg，加入0.Imol/L碳酸氨軸緩沖溶液4ml，攬拌使其充分溶解； (4) 將活化液加入到蛋白溶液中，室溫反應過夜； (5) 用0.Olmol/L的磯酸鹽緩沖液于4C透析3d，每天換3次透析液，W除去未反應的 小分子物質； (6) 分裝，于-2(TC保存?zhèn)溆谩?br>5. 權利要求3所述可樂定抗原在制備可樂定特異性抗體中的應用。
6. 應用權利要求3所述可樂定抗原制備得到的特異性抗體。
7. 權利要求1所述產(chǎn)物、權利要求3所述可樂定抗原、權利要求6所述抗體在檢測可樂 定中的應用。
8. 應用權利要求1所述產(chǎn)物、權利要求3所述可樂定抗原、權利要求6所述特異性抗體 制備得到的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
9. 權利要求8所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，它包括：包被有可樂定抗原的酶 標板、酶標抗體工作液、可樂定系列標準品、底物顯色液、終止液、濃縮復溶液、濃縮洗涂液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可樂定半抗原，相應的人工抗原和單克隆抗體，同時本發(fā)明也公開了所述可樂定半抗原，相應的人工抗原和單克隆抗體的制備方法及其應用。本發(fā)明提供的可樂定半抗原是式Ⅰ所示產(chǎn)物，用式Ⅰ所示產(chǎn)物與載體蛋白連接可以得到可樂定抗原。所述可樂定抗原可應用于制備可樂定特異性抗體。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明的可樂定人工抗原，通過免疫動物可產(chǎn)生了針對可樂定的特異性抗體，可用于制備檢測可樂定殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度高、特異性強等諸多優(yōu)點。
【IPC分類】C07K14-765, G01N33-577, C07K1-107, C07K14-795, C07K16-44, C07K14-77, C07D233-88, G01N33-531, C07K14-47
【公開號】CN104788383
【申請?zhí)枴緾N201410021591
【發(fā)明人】王世恩, 江海洋, 溫凱, 吳小平, 張桂亮, 金興, 楊艷紅, 成芳, 沈星辰, 邢佑尚, 許舒婷, 姚琳
【申請人】北京維德維康生物技術有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2014年1月17日