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      一種新型黑曲霉固定化細(xì)胞的制備及其對黃曲霉毒素b1的降解作用

      文檔序號:8468530閱讀:421來源:國知局
      一種新型黑曲霉固定化細(xì)胞的制備及其對黃曲霉毒素b1的降解作用
      【專利說明】一種新型黑曲霉固定化細(xì)胞的制備及其對黃曲霉毒素B1的降解作用
      [0001]本發(fā)明涉及一種利用一株新型誘變黑曲霉FS-UVl及HSCAS和凹凸棒制備的固定化細(xì)胞。特別是一種對黃曲霉毒素BI具有良好降解效果的菌株。
      【背景技術(shù)】
      [0002]真菌毒素對食品尤其是對糧食的危害極大,真菌可在糧食作物田間生長及收獲后儲(chǔ)藏過程中毒素的生物合成及代謝。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計(jì),全世界谷物供應(yīng)25%受真菌毒素污染而不能食用,對真菌毒素的防治成為保證食品安全刻不容緩的頭等大事。而微生物防治具有安全、高效、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用性強(qiáng)、環(huán)境友好型等優(yōu)勢,成為近年來備受推崇的防治方法。而真菌毒素中危害較大當(dāng)屬黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮以及嘔吐毒素。研宄表明多種細(xì)菌對黃曲霉毒素具有生物防治作用。如桿菌、伯克霍爾德菌、鏈霉菌、鏈球菌和乳酸菌等均可抑制產(chǎn)毒霉菌的生長,產(chǎn)毒作用。徐丹等已證實(shí)黑曲霉具有降解黃曲霉毒素BI的效果。早在19世紀(jì)初葉,人們發(fā)現(xiàn),某些微生物細(xì)胞具有一種吸附在固體物質(zhì)表面的天然傾向和特殊功能,并以這種方式被束縛,固定起來。當(dāng)時(shí),曾利用這種方式被吸附的微生物細(xì)胞,在滴濾反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)生產(chǎn)醋酸。此后,有人將類似的方法用于污水處理。從60年代開始,國際上固定化酶的研宄迅速發(fā)展起來,到70年代,作為酶源的微生物菌體本身的固定化,即固定化微生物,也引起了人們極大的注意。所謂固定化技術(shù),是指利用化學(xué)或物理手段將游離的細(xì)胞(微生物)或酶,定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活性和可反復(fù)使用的一種基本技術(shù)。包括固定化酶技術(shù)和固定化細(xì)胞技術(shù)。人們對一種較為理想的固定化載體有以下5個(gè)要求:a.具有高的載體活性,即固定化酶或微生物的活性回收率要高;b.材料容易獲得;c.價(jià)格便宜;d.操作制備方便,能適用于大規(guī)模生產(chǎn);e.有較高的機(jī)械強(qiáng)度,能較長時(shí)間使用和重復(fù)使用。目前,所采用的載體主要有以下幾種:瓊脂、明膠、海藻酸量添加少量海藻酸鈉和活性炭。固定化細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)在工業(yè),醫(yī)學(xué),化學(xué)分析,環(huán)境保護(hù),能源開發(fā)及理論研宄等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0003]本發(fā)明提供了一株新型黑曲霉,已于2011年7月I日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號CCTCC NO:M 2013553。
      [0004]本發(fā)明提供了一種固定化細(xì)胞,該固定化細(xì)胞對黃曲霉毒素具有良好的降解效果,在降解后2h,降解率達(dá)到95.3% ;較原菌株提高了 57.8%,并縮短了降解時(shí)間。
      [0005]所述誘變黑曲霉是經(jīng)紫外誘變中分離得到,其保藏條件如下:從生長良好的固態(tài)平板培養(yǎng)基上接取3環(huán)誘變黑曲霉到搖瓶培養(yǎng)基中,28°C搖床(200rpm)培養(yǎng)36h,取
      0.65mL移入含有0.3mL無菌甘油的甘油管中,放入_70°C超低溫冰箱保存。
      [0006]所述固態(tài)平板培養(yǎng)基PDA為(w/v):馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂20g、氯霉素
      0.lg、蒸飽水1L,自然pH, 121°C高壓滅菌15min。
      [0007]所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基PDB為(w/v):馬鈴薯300g、葡萄糖20g、蒸餾水1L、自然pH、121°C高壓滅菌15min。
      [0008]所述誘變黑曲霉的培養(yǎng)條件為:將已保藏甘油管的誘變黑曲霉接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基,28°C,130rpm,搖床培養(yǎng) 36h。
      [0009]將提純過200目篩的HSCAS粉體與有機(jī)改性劑(CTAB)按照1:1比例混合,通過機(jī)械力化學(xué)法改性3h,然后在一定條件下干燥,研碎過篩,即可獲得相應(yīng)的HSCAS粉體。
      [0010]將誘變黑曲霉接種到PDA固體培養(yǎng)基中,28°C,培養(yǎng)36h,取50ml生理鹽水洗下孢子,振蕩均勻,形成單孢子懸浮液,制成108CFU/ml的菌懸液,稱取不同質(zhì)量的改性HSCAS及凹凸棒(w:v)分別為 0.1%、0.3%、0.5%、1%,并在不同溫度(10°C、20°C、25°C、30°C、40°C ),不同pH(4,6,8,10及自然pH),磁力攪拌30min、50min。將固定化細(xì)胞用蒸餾水反復(fù)沖洗,將表面孢子沖洗干凈,充分靜置,最后將固定化細(xì)胞接種到30ml發(fā)酵液中,28°C,130rpm,搖床培養(yǎng)36h。向發(fā)酵液中加入0.05ppm AFBl比較黑曲霉及固定化細(xì)胞對AFBl的降解效果。
      [0011]本發(fā)明利用經(jīng)紫外誘變得到的新型黑曲霉FS-UVl與改性HSCAS及凹凸棒制備的對AFBl具有良好降解效果的固定化細(xì)胞,在降解時(shí)間為2h時(shí),較原菌株對AFBl提高了57.8%;縮短了降解時(shí)間。制備的固定化細(xì)胞可應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品,糧食以及飼料等領(lǐng)域中多種真菌毒素的降解中,達(dá)到降低黃曲霉毒素BI含量的目的。
      【附圖說明】
      [0012]圖1:新型黑曲霉FS-UV1-HSCAS固定化細(xì)胞制備條件優(yōu)化。圖中A,B,C分別為HSCAS-黑曲霉固定化細(xì)胞在不同pH,溫度,HSCAS:發(fā)酵液(w:v)的吸附效果比較。
      [0013]圖2:新型黑曲霉FS-UVl-凹凸棒固定化細(xì)胞制備條件優(yōu)化。圖中A,B,C分別為凹凸棒-黑曲霉固定化細(xì)胞在不同PH,溫度,凹凸棒:發(fā)酵液(w:v)的吸附效果比較。
      [0014]圖3:FS-UV1-HSCAS及FS-UVl-凹凸棒固定化細(xì)胞對黃曲霉毒素BI的降解效果比較。圖中a為凹凸棒-黑曲霉固定化細(xì)胞,b為HSCAS-黑曲霉固定化細(xì)胞,c為黑曲霉FS-UVl
      【具體實(shí)施方式】
      [0015]實(shí)施例1:新型黑曲霉FS-UVl的制備
      [0016]取50ml生理鹽水洗下孢子,振蕩均勻,形成單孢子懸浮液,制成108CFU/ml的菌懸液。取上述孢子懸液5ml經(jīng)200w紫外照射5min,微波處在高檔時(shí)加熱80s。將誘變后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基,在菌落上挑取適當(dāng)孢子制成108CFU/ml菌懸液,接種到30ml發(fā)酵液中,28°C 130rpm,搖床培養(yǎng)36h。吸取1ul發(fā)酵液在酪蛋白平板上進(jìn)行復(fù)篩。通過菌落特征觀察,個(gè)體形態(tài)觀察,并將菌株的18S rDNA與GenBank數(shù)據(jù)庫(http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中已知序列對比,發(fā)現(xiàn)其與黑曲霉(Aspergillus niger)同源性達(dá)100%。結(jié)合菌株的形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定,可確定菌株為黑曲霉。本菌株已于2011年7月I日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號CCTCC N0:M 2013553
      [0017]I)將篩選出來的黑曲霉菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)36h,取50ml生理鹽水洗下孢子,振蕩均勻,形成單孢子懸浮液。制成108CFU/ml的菌懸液。取上述孢子懸液5ml經(jīng)200w紫外照射5min,微波處在高檔時(shí)加熱80s。
      [0018]2)誘變后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基,從菌落中挑取適當(dāng)孢子制成108CFU/ml菌懸液,接種到30ml發(fā)酵液中,28°C培養(yǎng)36h。用打孔器在酪蛋白平板上打孔,吸取1ul發(fā)酵液滴入孔內(nèi)。選取蛋白水解圈較大的菌株則為復(fù)篩得到的菌株。
      [0019]實(shí)施例2:黑曲霉FS-UVl-凹凸棒固定化細(xì)胞的制備及條件優(yōu)化
      [0020]將誘變黑曲霉接種到PDA固體培養(yǎng)基中,28°C,36h,取50ml生理鹽水洗下孢子,振蕩均勾,形成單孢子懸浮液,制成108CFU/ml的菌懸液。稱取不同質(zhì)量的凹凸棒(w:v)分別為 0.1%、0.3%、0.5%、1% 并在不同溫度(10°C、20°C、25°C、30°C、40°C ),不同pH(4, 6, 8, 10及自然pH),磁力攪拌50min.并測定不同時(shí)間時(shí)560nm的吸光度。
      [0021]實(shí)施例3:新型黑曲霉FS-UV1-HSCAS固定化細(xì)胞的制備及條件優(yōu)化
      [0022]將誘變黑曲霉接種到PDA固體培養(yǎng)基中,28°C,36h,取50ml生理鹽水洗下孢子,振蕩均勻,形成單孢子懸浮液,制成108CFU/ml的菌懸液。稱取不同質(zhì)量的凹凸棒(w:v)分別為 0.1%、0.3%,0.5%、1%并在不同溫度(10°C、20°C、25°C、30°C、40°C ),不同pH(4, 6, 8, 10及自然pH),磁力攪拌50min.并測定不同時(shí)間時(shí)560nm的吸光度。
      [0023]實(shí)施例4:固定化細(xì)胞對AFBl的降解效果比較
      [0024]I)新型黑曲霉FS-UV-凹凸棒固定化細(xì)胞對AFBl的降解
      [0025]將復(fù)合誘變菌株FS-UVl及FS-UVl-凹凸棒固定化細(xì)胞接種到30ml發(fā)酵液中,280C 130rpm,搖床培養(yǎng)36h。向發(fā)酵液中加入0.05ppm黃曲霉毒素BI,從中吸取Iml并加入3ml三氯甲烷,萃取兩次,氮?dú)獯蹈?,加入三氟乙?0ul,正己烷200ul,衍生化30min,應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行檢測。色譜條件為C18柱6mmX 150mmX5um ;流動(dòng)相乙腈:水=20:80檢測溫度:30°C ;流速:lml/min ;檢測波長:激發(fā)波長:360nm ;發(fā)射波長:440nm
      [0026]2)新型黑曲霉FS-UV-HSCAS固定化細(xì)胞對AFBl的降解
      [0027]將復(fù)合誘變菌株FS-UVl及FS-UV1-HSCAS固定化細(xì)胞接種到30ml發(fā)酵液中,280C 130rpm,搖床培養(yǎng)36h。向發(fā)酵液中加入0.05ppm黃曲霉毒素BI,從中吸取Iml并加入3ml三氯甲烷,萃取兩次,氮?dú)獯蹈?,加入三氟乙?0ul,正己烷200ul,衍生化30min,應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行檢測。色譜條件為C18柱6mmX 150mmX5um ;流動(dòng)相乙腈:水=20:80檢測溫度:30°C ;流速:lml/min ;檢測波長:激發(fā)波長:360nm ;發(fā)射波長:440nm
      [0028]可以理解的是,對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說,可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變,而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1.一株誘變得到的黑曲霉菌株,于2013年11月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為:CCTCC N0:M2013553o其與凹凸棒、HSCAS(水合鋁硅酸鈉鈣)制備成固定化細(xì)胞。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化細(xì)胞,其特征在于該固定化細(xì)胞是利用在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h的孢子與不同材料制備的。
      3.權(quán)利要求2所述的固定化細(xì)胞,其特征在于所述固定化細(xì)胞是與凹凸棒、HSCAS制備的。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的HSCAS是由機(jī)械力化學(xué)法制備的有機(jī)HSCAS粉體。
      5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化細(xì)胞,其特征在于所述固定化細(xì)胞制備條件是凹凸棒、HSCAS對黑曲霉孢子吸附的飽和時(shí)間分別為40min,30min。
      6.權(quán)利要求4中所述的固定化細(xì)胞其特征在于黑曲霉-凹凸棒的最優(yōu)制備條件為0.1% (w:v),20°C,pH為自然,磁力攪拌50min ;黑曲霉-HSCAS的最優(yōu)制備條件為1%(w: v) ,40°C, pH 為 10,磁力攪拌 30min。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的固定化細(xì)胞應(yīng)用于降解對毒素污染的花生柏。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的固定化細(xì)胞在食品、飼料領(lǐng)域的應(yīng)用。
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種經(jīng)過紫外誘變的新型黑曲霉(Aspergillus niger)菌株FS-UV1,保藏編號CCTCC NO:M2013553,與凹凸棒及HSCAS制備而成的固定化細(xì)胞。該固定化細(xì)胞對黃曲霉毒素具有良好的降解效果,降解率達(dá)到95.3%;較原菌株提高了57.8%。CCTCC NO:M201355320131106
      【IPC分類】C12N11-08, C12N11-14, C12N1-14, A23L1-015, C12R1-685, A23K1-00
      【公開號】CN104789479
      【申請?zhí)枴緾N201410360250
      【發(fā)明人】孫秀蘭, 張曉雪, 孫超, 張銀志
      【申請人】江南大學(xué)
      【公開日】2015年7月22日
      【申請日】2014年7月25日
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