一種核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件及其應(yīng)用
【專利說明】一種核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件及利用其 構(gòu)建核酶介導(dǎo)的基因調(diào)控系統(tǒng)。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 通過控制DNA向mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA向蛋白質(zhì)的翻譯，能有效調(diào)芐基因的表達(dá)水 平。目前最常用的基因調(diào)控系統(tǒng)均是基于轉(zhuǎn)錄控制，即利用外源配體控制蛋白質(zhì)類反式作 用因子與啟動子的結(jié)合來起始或抑制轉(zhuǎn)錄過程，如四環(huán)素轉(zhuǎn)錄開關(guān)等，此類調(diào)控系統(tǒng)體積 龐大，需要專門的啟動子、反式作用因子，對宿主存在免疫毒性，難以滿足基因治療、基因功 能研宄等多種領(lǐng)域的需求。近年來，僅基于RNA的調(diào)控系統(tǒng)以其無免疫毒性、易于設(shè)計等優(yōu) 點得到廣泛關(guān)注。
[0003] 錘頭狀核酶（hammerhead ribozyme)是一類能自我裂解的RNA片段，該段RNA能 自我折疊形成特定的二級結(jié)構(gòu)：莖I、莖II和莖III，三條莖末端交聯(lián)形成"錘頭"狀結(jié)構(gòu)， 只有形成這樣的結(jié)構(gòu)才具有自我裂解活性，尤其是莖I、莖II中環(huán)狀結(jié)構(gòu)（loop)間的相互 作用對錘頭狀核酶在細(xì)胞內(nèi)的有效裂解必不可少。對于所有真核生物的mRNA來說，非編碼 區(qū)斷裂都將有效影響其翻譯效率，因此核酶適用于任何真核生物、任何基因的表達(dá)調(diào)控。
[0004] 核酸適體（aptamer)是一類能特異性結(jié)合配體的RNA片段，該RNA能與配體分 子一起形成高度穩(wěn)定的高級結(jié)構(gòu)，同樣的，該RNA只有預(yù)先形成特定的結(jié)構(gòu)才能與配體結(jié) 合。把適體連接到錘頭狀核酶的莖上，適體與配體分子結(jié)合前后結(jié)構(gòu)的變化會引起核酶結(jié) 構(gòu)的改變，使核酶失去或恢復(fù)自我裂解能力。如此得到的配體依賴型核酶（或稱變構(gòu)核酶， allosteric ribozyme)可以插入到mRNA的非編碼區(qū)，作為一種順式元件對目的基因?qū)崿F(xiàn) 緊密調(diào)控。目前雖有大量配體依賴型核酶被篩選或設(shè)計出來，但能用于哺乳動物細(xì)胞基因 調(diào)控的非常少，尤其是ON型調(diào)控（即基因表達(dá)量隨配體濃度的增加而上升）更少；且目前 文獻(xiàn)所報道的ON型核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件，均將適體與錘頭狀核酶的莖II連接，但由于 莖II對于錘頭狀核酶的細(xì)胞內(nèi)裂解活性極其重要，適體序列的插入不利于核酶活性構(gòu)象 的形成；在沒有配體時，核酶不能充分形成活性構(gòu)象，造成基因的表達(dá)泄露；在有配體存在 時，核酶活性構(gòu)象也不能充分被抑制，降低了基因表達(dá)效率；因此，目前的ON型核酶型基因 表達(dá)調(diào)控元件的基因表達(dá)調(diào)控不夠嚴(yán)謹(jǐn)，即在配體濃度為0時目的基因存在較多的泄露表 達(dá)。也有人將適體連接在錘頭狀核酶的莖III上，但得到的均為OFF型基因表達(dá)調(diào)控元件。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種長度較短的核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件， 并揭露了利用該調(diào)控元件構(gòu)建的能夠有效調(diào)控基因表達(dá)的核酶介導(dǎo)的基因調(diào)控系統(tǒng)。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的：
[0007] 一種核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0008] 同時揭露了利用該核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)建的核酶介導(dǎo)的基因調(diào)控系統(tǒng)，具 體地，在目的基因的非編碼區(qū)插入所述核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件的核苷酸序列，當(dāng)目的基 因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，向宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加茶堿，則目的基因表達(dá)水平將隨茶堿濃度 的增加而提升。
[0009] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0010] 提供了一種核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件，其具有長度短小精湛，在各種真核細(xì)胞中 均能展現(xiàn)出ON型調(diào)控性能，且利用該核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)建的核酶介導(dǎo)的基因調(diào) 控系統(tǒng)，能夠便捷、有效地調(diào)控基因的表達(dá)，從而能夠為基因治療、基因功能研宄等領(lǐng)域拓 寬了平臺。 【【附圖說明】】
[0011] 下面參照附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0012] 圖1是本發(fā)明一種核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件的構(gòu)象示意圖。
[0013] 圖2是實施例1中設(shè)計的核酶在Hela細(xì)胞中對海腎熒光素酶（hRluc)表達(dá)的調(diào) 控效果圖。
[0014] 圖3是實施例2中設(shè)計的核酶與已有變構(gòu)核酶調(diào)控系統(tǒng)的比較圖。
[0015] 圖4是實施例3中失活核酶與激活核酶序列作用下hRluc的表達(dá)水平圖。
[0016] 圖5是實施例3中的調(diào)控效果曲線圖。
[0017] 圖6是實施例4中的調(diào)控效果比較圖。 【【具體實施方式】】
[0018] 為了能夠更好的理解本發(fā)明，申請人進(jìn)行了以下實施例，且各實施例中所采用的 均為常規(guī)實驗方法，所用試劑、耗材均購自常規(guī)生化試劑商店。
[0019] 質(zhì)粒載體psiCHECKTM-2購自Promega公司，該載體含有一個海腎熒光素酶報告 基因（hRluc)，并含有螢火蟲熒光素酶基因（Flue)作為內(nèi)參。核酶序列（SmTheo)即本發(fā) 明核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件的序列由上海生工生物有限公司合成，并通過酶切位點Xhol 和Pmel插入到質(zhì)粒載體psiCHECKTM-2中hRluc基因的3' UTR，作為實驗載體；細(xì)胞裂解 液及熒光素酶檢測試劑盒均購自Promega公司；茶堿購自阿拉丁試劑公司；Hela細(xì)胞購自 八丁0：，使用含10%牛血清的1^頂-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于5%0) 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中；以10000個 /孔鋪于96孔板上，融合度達(dá)到90 %以上時，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染實驗或?qū)φ?載體，24h后更換新鮮的、含指定濃度茶堿的培養(yǎng)基；培養(yǎng)24h后裂解細(xì)胞，并先后檢測各孔 中Flue、hRluc的螢光值，目的基因hRluc的表達(dá)水平根據(jù)下式計算：
【主權(quán)項】
1. 一種核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件，其特征在于：該調(diào)控元件的核苷酸序列如SEQID NO: 1所示。
2. -種核酶介導(dǎo)的基因調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于：在目的基因的非編碼區(qū)插入權(quán)利要求 1所述核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件的核苷酸序列，當(dāng)目的基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，向宿主細(xì)胞的 培養(yǎng)基中添加茶堿，則目的基因表達(dá)水平將隨茶堿濃度的增加而提升。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；并同時揭露了利用該調(diào)控元件構(gòu)建的核酶介導(dǎo)的基因調(diào)控系統(tǒng)，具體地，在目的基因的非編碼區(qū)插入所述核酶型基因表達(dá)調(diào)控元件的核苷酸序列，當(dāng)目的基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，向宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加茶堿，則目的基因表達(dá)水平將隨茶堿濃度的增加而提升。本發(fā)明所公開的調(diào)控元件短小精湛，在各種真核細(xì)胞中均能展現(xiàn)出ON型調(diào)控性能，且所構(gòu)建的基因調(diào)控系統(tǒng)能夠便捷、有效地調(diào)控基因的表達(dá)，從而能夠為基因治療、基因功能研究等領(lǐng)域拓寬了平臺。
【IPC分類】C12N15-85, C12N15-113
【公開號】CN104789565
【申請?zhí)枴緾N201510151449
【發(fā)明人】王佳穩(wěn), 刁勇
【申請人】華僑大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月1日